本发明涉及生物催化，具体涉及一种酶法合成d-苯甘氨酸的方法，特别涉及一种以利用腈水解活性的酶催化合成d-苯甘氨酸的方法。
背景技术：
1、d-苯甘氨酸是一种非天然氨基酸，它是合成医药β-内酰胺类抗生素的重要中间体，作为氨苄青霉素、叠氮头孢、头孢克罗、匹夫氨苄等的重要侧链而广泛应用于制药领域。因为d-苯甘氨酸合成后的药物口服和注射均可，所以在国内外医药市场应用前景广阔。同时，它还是合成各种多肽激素、多种农药的重要中间体。因此，开发绿色、高效的d-苯甘氨酸合成技术成为国内外重要的研究目的。
2、目前，d-苯甘氨酸的制备技术主要包括化学合成法和生物法。化学合成法虽比较成熟，但此方法制备过程中需要高温高压、强酸强碱等极端条件，对操作人员要求较高且会产生不利于环境的有毒物质。而生物催化合成d-苯甘氨酸具有反应条件温和、步骤简单以及可持续发展等显著优势，已成为制备手性羧酸的重要方法。但国内外关于利用腈水解酶生物催化合成d-苯甘氨酸的相关报道很少。生物催化法反应条件温和、催化剂特异性高、选择性强、能耗少、催化剂制作成本低廉、工艺环境友好，产生显著的经济效益，因此，生物催化是绿色化学与绿色化工发展的重要趋势之一。但是野生菌普遍存在酶活表达量低，稳定性较差，对底物和底物的耐受性不高等缺点。随着基因工程技术的迅猛发展，可以通过分子改造构建基因工程菌，提高腈水解酶的活性、稳定性及底物耐受性等催化性能的同时提高转化率。
技术实现思路
1、本发明提供了一种酶法合成d-苯甘氨酸的方法，通过单酶催化合成d-苯甘氨酸。
2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种d-苯甘氨酸的合成方法，包括以下步骤：
3、以2-苯氨基乙腈为底物，利用所述的腈水解酶进行催化反应，反应产物为d-苯甘氨酸。
4、优选的，所述的腈水解酶来源于：荧光假单胞菌（ pseudomonas fluorescens）、肺炎克雷伯杆菌（ klebsiella pneumoiae）、粪产碱杆菌（ alcaligenes faecalis）。
5、优选的，来源于荧光假单胞菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；
6、优选的，来源于肺炎克雷伯杆菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq id no.4所示；
7、优选的，来源于粪产碱杆菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。
8、优选的，所述腈水解酶以粗酶液或全细胞的形式加入。
9、优选的，所述催化反应的温度为20~37℃，所述催化反应的时间为12~24h。
10、优选的，当所述的腈水解酶是以粗酶液的形式加入时，所述的腈水解酶在反应体系中的浓度为30od600/ml；
11、当所述的腈水解酶以全细胞的形式加入时，所述全细胞的浓度为30od600/ml。
12、优选的，所述催化反应在浓度为50~100mm，ph值为6.5~8.5的磷酸盐缓冲液中进行。
13、优选的，当所述腈水解酶是以粗酶液或全细胞的形式加入时，所述催化体系含有2-苯氨基乙腈、磷酸水溶液和所述腈水解酶。
1.一种改良的腈水解酶，其特征在于，所述改良的腈水解酶的氨基酸序列如seq idno.2、seq id no.4或seq id no.6所示。
2.权利要求1所述改良的腈水解酶的编码基因，其特征在于，编码所述改良的腈水解酶的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示。
3.一种含权利要求2所述编码基因的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述编码基因并表达权利要求1所述改良的腈水解酶的重组工程细胞。
5.一种酶法合成d-苯甘氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：以2-苯氨基乙腈为底物，利用权利要求1所述改良的腈水解酶或权利要求4所述重组工程细胞进行催化反应，反应产物包括d-苯甘氨酸。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，当加入所述改良的腈水解酶时，所述改良的腈水解酶在反应体系中的浓度为30od600/ml。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，当加入所述重组工程细胞时，所述全细胞的浓度为30od600/ml。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述催化反应的温度为25-37℃，所述催化反应的时间为12-24h。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述催化反应在浓度为50-100mm，ph值为6.5-8.5的磷酸盐缓冲液中进行。
