本发明属于病毒检测，具体涉及一种检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒及应用和非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法。
背景技术：
1、牛病毒性腹泻(bvd)是由牛病毒性腹泻病毒(bvdv)引起的一种在世界范围内广泛流行的传染病。bvdv感染的情况常爆发于冬天与春天的季节交替时刻，不同年龄段的牛均可被感染，12至24月龄的牛更为易感，被感染的牛常出现高烧、食欲不振、眼鼻分泌物增加、腹泻等症状，严重时会出现败血症甚至是肺炎。在感染期牛的抵抗力变弱，免疫力急速降低，此时其他病原也会进入牛体内，随后出现继发性及合并性的交叉感染，如口蹄疫、布病等疫苗免疫失败及其他病毒或细菌的继发感染。bvdv的传播有直接接触传播和间接接触传播，且其感染引起的免疫抑制是导致牛群不稳定的关键因素。而对于养殖场来说，bvdv的防范重点是持续感染(persistent infection，pi)牛，由于pi牛终生携带病毒，且病毒会随其分泌物或排泄物排出，但在牛体内却不产生bvdv抗体，所以准确的鉴定及分辨pi牛尤为重要。
2、因此，现有技术中，申请号202410181708.5的中国发明专利公开了一种基于crispr-cas12a的bvdv特异crrna及其相关试剂盒与检测方法，试剂盒包括bvdv特异crrna，bvdv 5'utr基因等温扩增试剂、ispr-cas12a蛋白酶，ssdna报告系统，核酸酶抑制剂和nebuffer 3.1，其中bvdv特异crrna为seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4和seq idno.5所示的crrna等比例混合。本发明技术能够在30分钟内检测低至10个拷贝载量的病毒，并识别bvdv-1和bvdv-2亚型病毒。然而，bvdv基因差异很大，最为保守的基因为5′utr，因而依据非翻译区的保守情况将bvdv主要分为两个类型：bvdv-1(pestivirusa)、bvdv-2(pestivirus b)，其中bvdv-1最为流行，精确检测bvdv-1对于牛病毒性腹泻的准确快速诊断、预防具有重要意义。而上述现有技术中，存在对bvdv-1的检测特异性不够强，灵敏度也需进一步提高的问题。
技术实现思路
1、基于此，本申请公开了一种检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒及应用和非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，解决了现有技术中对bvdv1的检测特异性不够强，灵敏度也需进一步提高的技术问题。
2、本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
3、一种检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，所述试剂盒内包括扩增引物f1、r2，及bvdv特异crrna；
4、其中所述扩增引物序列为：
5、f1：5'-ccctgagtacagrgyagtcgtcagtggttcgac-3'，
6、r2：5'-gatcaactccatgtgccatgtacagcagag-3'；
7、所述bvdv特异crrna序列为：
8、5'-ggguaauuucuacuaaguguagauggcaugcccucguccacgug-3'。
9、优选地，上述检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，所述试剂盒中还含有lbcas12a蛋白酶、ssdna报告系统、切割缓冲液。
10、优选地，上述检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，所述切割缓冲液包括：10mm tris-hcl、50mm nacl、10mm mgcl2以及重组白蛋白。
11、上述试剂盒在非疾病诊断目的的bvdv1可视化检测中的应用。
12、一种非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，其特征在于，采用上述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
13、s1.提取待检样本中病毒的rna；
14、s2.将s1获得的所述rna和所述扩增引物f1、r2加入到逆转录-重组酶聚合酶扩增体系中进行扩增，获得特异性产物；
15、s3.将s2获得的所述特异性产物加入crispr-cas12a检测体系中，对所述特异性产物进行识别切割；
16、s4.利用荧光酶标仪或荧光灯肉眼直接检测判读待测样品中是否存在bvdv1特异性核酸。
17、优选地，上述非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法步骤s3中，所述crispr-cas12a检测体系为30μl，包含：10×切割缓冲液3μl、1μm lbcas12a蛋白酶1μl、1μm crrna1.5μl、10μm ssdna报告系统1.2μl、rpa扩增产物5μl、depc h2o 18.3μl。
18、优选地，上述非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，步骤s3中，检测条件为：40℃，每1min收集一次荧光，30min。
19、采用本申请方案至少具有以下优点：
20、本发明采用两步法引物筛选，筛选出引物f1、r2与crrna3组合检测性能最好，本申请方案的检测方法能够在30分钟内检测低至10个拷贝载量的bvdv1病毒，检出率100％，并且不与其他共感染病原体发生交叉反应，具有高灵敏度和强特异性。本发明中对200个临床样本进行了检测，准确率达到100％。本发明所述的试剂盒使用简单，检测方便快速，且灵敏度高、特异性强，检测结果可视化，直观清楚，有利于推广应用。
1.一种检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括扩增引物f1、r2，及bvdv特异crrna；
2.根据权利要求1所述的检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有lbcas12a蛋白酶、ssdna报告系统、切割缓冲液。
3.根据权利要求2所述的检测牛腹泻病毒bvdv1的试剂盒，其特征在于，所述切割缓冲液包括：10mm tris-hcl、50mm nacl、10mm mgcl2以及重组白蛋白。
4.权利要求1至3任一所述试剂盒在非疾病诊断目的的bvdv1可视化检测中的应用。
5.一种非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，其特征在于，采用权利要求1至3任一项所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，其特征在于，步骤s3中，所述crispr-cas12a检测体系为30μl，包含：10×切割缓冲液3μl、1μm lbcas12a蛋白酶1μl、1μm crrna 1.5μl、10μm ssdna报告系统1.2μl、rpa扩增产物5μl、depc h2o 18.3μl。
7.根据权利要求5所述的非疾病诊断目的的可视化检测bvdv1的方法，其特征在于，步骤s3中，检测条件为：40℃，每1min收集一次荧光，30min。
