本发明涉及一种鸽蛋清中唾液酸糖蛋白的提取方法，属于生物、医药和食品技术加工领域。
背景技术：
1、卵白蛋白是蛋清蛋白的主要组成部分，具有抗氧化、降血压、免疫调节、血管紧张抑制等生物生理功能，能够作为生化试剂、营养补充剂和药物等，在生物与医药领域有很高的应用价值。鸽蛋具有补肾益气、美容养颜和补充营养等滋补功效，其蛋白成分鸽蛋清中含有大量优质蛋白质。鸽蛋清中蛋白质的氨基酸组成和糖基化位点与鸡蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋等其他禽蛋来源的蛋白均有较大区别，因此，其在结构和功能上具有一定的特殊性，挖掘鸽蛋清中特殊功能蛋白的提取分离方法具有重要意义。
2、目前已经有报道以鸡蛋清等(非鸽蛋清)为原料制备卵白蛋白的方法，比如有吸附法、盐析法、亲和色谱法、分级沉淀法、超滤法和微滤法等，但是这些方法存在操作繁琐、成本较高、得率不高、纯度较低、或对设备有一定要求等问题，限制了在工业上的大规模应用，而且通常情况下，适合以鸡蛋清为原料的提取方法不适用于鸽蛋清。在前期的研究过程中，发明人团队在授权公告号cn116421708b《鸽蛋清中卵白蛋白的提取及其在伤口修复方面的应用》，参考以鸡蛋清为原料的方法来提取鸽蛋清中卵白蛋白，发现提取效率不高。
3、另外，卵白蛋白具有两种旁系同源物，即卵白蛋白伴随y蛋白(分子量约44kda)和卵白蛋白伴随x蛋白(分子量约43kda)。卵白蛋白伴随y蛋白在鸡蛋中含量非常少，却是鸽蛋清中最主要的蛋白，含量占50％以上。在前期的研究过程中，发明人团队发现，鸽蛋清来源的卵白蛋白伴随y蛋白的糖链唾液酸化程度达80％以上，该蛋白具有促进伤口修复、保湿抗衰老功效，可应用至化妆品、保健食品和特殊医学用途食品等领域。
4、已有报道显示，授权公告号cn112028990b《一种鸽蛋清卵白蛋白的提取方法》公开了一种鸽蛋清卵白蛋白的提取方法，主要通过分三步加入盐析试剂进行盐析反应，且最后的产物为鸽蛋清卵白蛋白，而非卵白蛋白伴随y蛋白。此外，发明人团队在授权公告号cn116421708b《鸽蛋清中卵白蛋白的提取及其在伤口修复方面的应用》中成功使用改进的双水相体系萃取方法从鸽蛋清中提取到了卵白蛋白伴随y蛋白和卵白蛋白伴随x蛋白，该方法是先经过一系列操作得到卵白蛋白混合物，然后经过复溶、调节ph等操作使得卵白蛋白伴随y蛋白和卵白蛋白伴随x蛋白分离，得到卵白蛋白伴随y蛋白；此法虽能获得卵白蛋白伴随y蛋白，但操作较繁琐，得率有待提高，不适合工业化应用。
5、综上所述，卵白蛋白伴随y蛋白(ovay)是鸽蛋清中含量较高、具有一定应用价值的蛋白，但是目前从鸽蛋中提取卵白蛋白伴随y蛋白的方法报道非常有限，或者存在提取效率有待提高、操作繁琐等问题，因此有必要开发出一种高效、成本低、操作简单的能直接从鸽蛋清中提取卵白蛋白伴随y蛋白的方法，这将有利于扩宽鸽蛋清应用，制备具有较高附加值的产品。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明通过采用改进的盐析法直接提取到了卵白蛋白伴随y蛋白。该方法所用工艺操作简单快捷、无需复杂设备、适用于工业化生产，同时，提取效率高、产品纯度高且生物活性完好。此外，本发明进一步验证，鸽蛋清来源的卵白蛋白伴随y蛋白是一种唾液酸糖蛋白，该蛋白约83％的糖链是唾液酸化的。
2、本发明的第一个目的是提供一种从鸽蛋清中直接提取卵白蛋白伴随y蛋白的方法，包括如下步骤：
3、(1)制备鸽蛋清溶液；
4、(2)按标准方法配制硫酸铵饱和溶液，将硫酸铵固体加入硫酸铵饱和溶液上清后搅拌，得到混合溶液；
5、(3)将步骤(1)所得溶液快速加入到步骤(2)所得混合溶液中，使硫酸铵的终浓度为0.60～0.69g/ml，搅拌混匀后盐析；
6、(4)离心取上清液，透析除去盐离子，真空冷冻干燥后即得所述卵白蛋白伴随y蛋白。
7、在一种实施方式中，所述步骤(1)中鸽蛋清溶液，是指新鲜鸽蛋清制成的鸽蛋清溶液或鸽蛋清干粉用水复溶制成的鸽蛋清粉复溶液；其中，鸽蛋清的干重或鸽蛋清干粉与水的质量比为1：20～50；优选地，所述鸽蛋清溶液中鸽蛋清干重或鸽蛋清干粉与水的质量比为1：20。
8、在一种实施方式中，所述鸽蛋清干粉是将分离的鸽蛋清冻干或不超过50℃烘干得到的。
9、在一种实施方式中，所述步骤(2)中硫酸铵饱和溶液在常温下按照767g/l的浓度配制，磁力搅拌24h后取上清液得到硫酸铵饱和溶液上清。
10、在一种实施方式中，所述硫酸铵固体的添加量与鸽蛋清溶液中水的质量比为3：5；所述硫酸铵饱和溶液上清的使用体积要根据最终体系的硫酸铵浓度计算。
11、在一种实施方式中，所述鸽蛋清溶液中水的质量，是指步骤(1)中鸽蛋清溶液去除鸽蛋清干重或鸽蛋清干粉后的质量。
12、在一种实施方式中，所述步骤(3)中搅拌5～10min混匀后盐析8～16h。
13、在一种实施方式中，所述步骤(4)中离心转速以及时间为6000～8000rpm，10～15min；所述透析方式为使用小于40kd的透析袋透析；可选地，所述透析方式为使用3000da的透析袋透析。
14、在一种实施方式中，所述方法提取的卵白蛋白伴随y蛋白的纯度为99％以上，回收率为26％～54％。
15、本发明的第二个目的是提供一种鸽蛋清中糖链唾液酸化程度达80％以上的唾液酸糖蛋白的提取方法，所述方法是以鸽蛋清为原料，提取鸽蛋清中的卵白蛋白伴随y蛋白。
16、在一种实施方式中，所述卵白蛋白伴随y蛋白在ncbi上登录号为pkk33949.1，蛋白分子量约为44kda，糖链分子量为18.63kda。
17、在一种实施方式中，所述卵白蛋白伴随y蛋白的糖链部分主要由唾液酸、甘露糖、氨基葡萄糖和半乳糖组成，通过特殊n-糖基化形成糖蛋白结构。
18、在一种实施方式中，所述卵白蛋白伴随y蛋白约83％的糖链是唾液酸化的。
19、在一种实施方式中，所述方法提取的卵白蛋白伴随y蛋白(唾液酸糖蛋白)的纯度为99％以上，回收率为26％～54％。
20、在一种实施方式中，所述唾液酸糖蛋白的提取方法，包括如下步骤：
21、(1)制备鸽蛋清溶液，为新鲜鸽蛋清制成的鸽蛋清溶液或鸽蛋清干粉用水复溶制成的鸽蛋清粉复溶液，鸽蛋清溶液中鸽蛋清干重或鸽蛋清干粉与水的质量比为1：20～50；
22、(2)按标准方法配制硫酸铵饱和溶液，将硫酸铵固体加入硫酸铵饱和溶液上清后搅拌，得到混合溶液；硫酸铵固体的添加量与鸽蛋清溶液中水的质量比是3：5，硫酸铵饱和溶液上清的使用体积根据最终体系的硫酸铵浓度计算；
23、(3)将步骤(1)所得溶液快速加入到步骤(2)所得混合溶液中，使硫酸铵的终浓度为0.60～0.69g/ml，搅拌混匀后盐析8～16h；
24、(4)离心取上清液，透析除去盐离子，真空冷冻干燥后即得所述唾液酸糖蛋白。
25、本发明的优点和效果：
26、(1)本发明开发了一种鸽蛋清中卵白蛋白伴随y蛋白(唾液酸糖蛋白)的提取方法，本方法具有条件温和、得率高、操作简单、所需设备成本低等优点，适用于大规模工业化生产。
27、(2)本发明方法所制备的鸽蛋清卵白蛋白伴随y蛋白，颜色纯白、水溶性高、纯度高于99％，色泽和复水溶解性好，极大程度上保留了蛋白的结构和生物活性。
28、(3)根据本发明方法所得到的鸽蛋清卵白蛋白伴随y蛋白是一种唾液酸糖蛋白，唾液酸能够抑制细菌、病毒以及其他有害分子与细胞的结合，还可以调节炎症反应和免疫细胞之间的相互作用，影响免疫细胞的活化状态，帮助免疫细胞识别和清除有害物质。
1.一种从鸽蛋清中直接提取卵白蛋白伴随y蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中鸽蛋清溶液，是指新鲜鸽蛋清制成的鸽蛋清溶液或鸽蛋清干粉用水复溶制成的鸽蛋清粉复溶液；其中，鸽蛋清的干重或鸽蛋清干粉与水的质量比为1：20～50；优选地，所述质量比为1：20。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中硫酸铵固体的添加量与鸽蛋清溶液中水的质量比为3：5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透析方式为使用小于40kd的透析袋透析；优选地，所述透析方式为使用3000da的透析袋透析。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鸽蛋清干粉是将分离的鸽蛋清冻干或不超过50℃烘干得到的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中离心转速为6000～8000rpm，离心时间为10～15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵白蛋白伴随y蛋白在ncbi上登录号为pkk33949.1，蛋白分子量约为44kda，糖链分子量为18.63kda。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵白蛋白伴随y蛋白的糖链部分主要由唾液酸、甘露糖、氨基葡萄糖和半乳糖组成，通过特殊n-糖基化形成糖蛋白结构；所述卵白蛋白伴随y蛋白80％以上的糖链是唾液酸化的，为唾液酸糖蛋白。
9.一种鸽蛋清中糖链唾液酸化程度达80％以上的唾液酸糖蛋白的提取方法，所述方法是以鸽蛋清为原料，提取鸽蛋清中的卵白蛋白伴随y蛋白；可选地，所述提取方法是采用权利要求1-8任一所述的方法来提取卵白蛋白伴随y蛋白。
10.根据权利要求9所述唾液酸糖蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
