一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法。


背景技术：

2.多能性干细胞是指能够发育为身体的所有类型的干细胞，但不能发育为胚外组织（还是胎盘），胚胎干细胞是来自于卵裂期之后的囊胚的内细胞团，是多能性干细胞的一种，一般而言，多能性干细胞除了胚胎干细胞，还可以是ipsc（诱导多能性干细胞），专能干细胞（multipotent stem cell，也有翻译成“多能”干细胞的）是指能发育为一系列体细胞但不具备发育为所有体细胞类型的干细胞。
3.造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能，它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义，而多能干细胞向造血干细胞分化的目的在于通过多能干细胞扩增分化为造血干细胞或修复造血干细胞，以此来治疗血液性疾病，对于医疗科技有重大的意义，而现有的分化扩增手段不仅难度大，成本高，同时分化后的细胞成活率低，细胞强度弱，进而现在提出一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法来解决以上的技术问题。


技术实现要素：

4.（一）发明目的为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，本发明通过不同培养液基础上产生的培养基中，能够实现在恒温、正常氧气浓度情况下多方main诱导多能干细胞向造血干细胞分化，且利用基底膜提取物和玻连蛋白为干细胞分化提供养分，使得降低分化成本的同时，缩减了添加培养液的工序，进而形成状态强度稳定的造血干细胞，同时本发明中的化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分化效率高，能够为生物制药相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
5.（二）技术方案本发明提供了一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，包括基底膜提取物、玻连蛋白和细胞培养基；其中还包括多能干细胞向造血干细胞分化的方法，具体有以下的步骤：s1：制备基底膜提取物；s2：制备玻连蛋白；s3：制备培养基，并将制备的基底膜提取物和玻连蛋白放入培养基中培养s4：处理诱导性多能干细胞，并放入培养基中与基底膜提取物和玻连蛋白一起培养，得到扩增分化后的造血干细胞。
6.作为本发明一种优选的方案，所述步骤s1中的基底膜提取物制备具体步骤如下：s1：将干细胞进行纯化反应后提取可溶性的基底膜提取物，并将该基底膜提取物进行聚合反应后冷冻，获得凝胶基质；s2：将凝胶基质解冻后稀释在培养基中，进行冷藏处理。
7.作为本发明一种优选的方案，所述步骤s2中的玻连蛋白制备有如下的制备步骤：将玻连蛋白储存在-80
°
c的环境中，解冻后等分试样，利用pbs试剂稀释后置于培养基中包被室温下孵育。
8.作为本发明一种优选的方案，所述步骤s3中的培养基制备有如下的步骤：步骤1：将冷藏的补剂取出并解冻，在无菌环境下添加到基础培养基中；步骤2：随后在避免光照的情况下将培养基加热至室温，获得培养基。
9.作为本发明一种优选的方案，所述补剂为氨基酸、胰岛素或水乳蛋白中的任意一种。
10.作为本发明一种优选的方案，步骤s4中诱导性多能干细胞的处理步骤如下：步骤1：在水浴中轻轻旋转冷冻管，将诱导性多能干细胞解冻，打开前用70％乙醇或等效消毒剂对冷冻管进行消毒；步骤2用无菌移液管，将冷冻保护剂以及细胞混合物从冷冻管转移到离心管中；步骤3：在室温下，缓慢地逐滴向离心管中适当的培养液，轻轻前后摇动离心管，将细胞离心后，去除并倒掉上清液，并加入添加适量的培养液；步骤4：轻拍离心管，使细胞沉淀脱离，并接种到包被的6孔板中，轻轻摇动板，以使细胞均匀铺展在整个孔中培养。
11.与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：综上所述，本发明通过不同培养液基础上产生的培养基中，能够实现在恒温、正常氧气浓度情况下多方main诱导多能干细胞向造血干细胞分化，且利用基底膜提取物和玻连蛋白为干细胞分化提供养分，使得降低分化成本的同时，缩减了添加培养液的工序，进而形成状态强度稳定的造血干细胞，同时本发明中的化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分化效率高，能够为生物制药相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
附图说明
12.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
13.图1为本发明的细胞分化数量示意图；图2为本发明的细胞分化速度示意图。
14.下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。在本发明中，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的，在本发明中，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症
状，在本发明中，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人类，特别是人类。
15.本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体实施方式
16.下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。应当理解，在所有这些附图中，相同或相似的附图标记指示相同的或相似的零件及特征。各个附图仅示意性地表示了本公开的实施方式的构思和原理，并不一定示出了本公开各个实施方式的具体尺寸及其比例。在特定的附图中的特定部分可能采用夸张的方式来图示本公开的实施方式的相关细节或结构。
17.实施例一：一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法：干细胞中的凝胶基质从肿瘤细胞中纯化处理出可溶性基底膜提取物，基质在20-40℃环境下聚合，形成重构的基底膜，将凝胶基质解冻后稀释在培养基中，进行冷藏处理，解冻后，使用移液器将基底膜提取物放入培养基中，用dmem培养基稀释基底膜提取物，稀释比例为1:80，获得ecm凝胶基质；将1:80稀释的ecm凝胶基质加入6孔板的每个孔中，旋转培养板，以使ecm凝胶基质均匀地铺展在板的表面上，并将其存放在2-8℃的环境中冷藏过夜至少2小时，或用保鲜膜将ecm凝胶基质包被，并储存于2-8℃环境中；将玻连蛋白在室温下解冻，并在无菌聚丙烯管中制备等分试样，将等分试样冷冻保存，解冻后将pbs缓冲液与玻连蛋白轻轻混合，以1:100比例稀释玻连蛋白，向6孔板的每个孔中加入稀释的玻连蛋白，并包被室温下孵育1小时；无菌环境中取出基础培养基，并向基础培养基中加入胰岛素补剂，将培养基等分成培养1周所需的体积，使用前，将基础培养基温热至室温程度后，避免光照将培养基在室温下放置；将装有诱导性多能干细胞的冷冻管置于37℃的水浴中，解冻细胞，在水浴中轻轻旋转冷冻管，打开前用70％乙醇或等效消毒剂对冷冻管进行消毒，用5 ml无菌移液管，将冷冻保护剂以及细胞混合物从冷冻管转移到离心管中，在室温下，缓慢地逐滴向离心管中加入适当的培养液，轻摇离心管，同时加入几滴培养液，并将细胞离心2分钟，去除并倒掉上清液；在接种细胞之前，将盛有ecm凝胶基质的板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入诱导性多能干细胞，培养5-10分钟后，将板上的细胞取出放入盛有氨基酸补剂的培养基中，同时加入玻连蛋白，培养一段时间后，将培养中的细胞提取放入离心管中，轻拍离心管，以使细胞沉淀脱离，使细胞均匀铺展在培养皿中，并加入培养液，在培养一段时间后获得分化后的造血干细胞。
18.实施例二：一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，其在实施例一
的基础上，将培养基中的胰岛素补给更换成氨基酸补剂；干细胞中的凝胶基质从肿瘤细胞中纯化处理出可溶性基底膜提取物，基质在20-40℃环境下聚合，形成重构的基底膜，将凝胶基质解冻后稀释在培养基中，进行冷藏处理，解冻后，使用移液器将基底膜提取物放入培养基中，用dmem培养基稀释基底膜提取物，稀释比例为1:80，获得ecm凝胶基质；将1:80稀释的ecm凝胶基质加入6孔板的每个孔中，旋转培养板，以使ecm凝胶基质均匀地铺展在板的表面上，并将其存放在2-8℃的环境中冷藏过夜至少2小时，或用保鲜膜将ecm凝胶基质包被，并储存于2-8℃环境中；将玻连蛋白在室温下解冻，并在无菌聚丙烯管中制备等分试样，将等分试样冷冻保存，解冻后将pbs缓冲液与玻连蛋白轻轻混合，以1:100比例稀释玻连蛋白，向6孔板的每个孔中加入稀释的玻连蛋白，并包被室温下孵育1小时；无菌环境中取出基础培养基，并向基础培养基中加入氨基酸补剂，将培养基等分成培养1周所需的体积，使用前，将基础培养基温热至室温程度后，避免光照将培养基在室温下放置；将装有诱导性多能干细胞的冷冻管置于37℃的水浴中，解冻细胞，在水浴中轻轻旋转冷冻管，打开前用70％乙醇或等效消毒剂对冷冻管进行消毒，用5 ml无菌移液管，将冷冻保护剂以及细胞混合物从冷冻管转移到离心管中，在室温下，缓慢地逐滴向离心管中加入适当的培养液，轻摇离心管，同时加入几滴培养液，并将细胞离心2分钟，去除并倒掉上清液；在接种细胞之前，将盛有ecm凝胶基质的板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入诱导性多能干细胞，培养5-10分钟后，将板上的细胞取出放入盛有氨基酸补剂的培养基中，同时加入玻连蛋白，培养一段时间后，将培养中的细胞提取放入离心管中，轻拍离心管，以使细胞沉淀脱离，使细胞均匀铺展在培养皿中，并加入培养液，在培养一段时间后获得分化后的造血干细胞。
19.实施例三：一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，其在实施例一的基础上，将胰岛素补剂更换成水乳蛋白；干细胞中的凝胶基质从肿瘤细胞中纯化处理出可溶性基底膜提取物，基质在20-40℃环境下聚合，形成重构的基底膜，将凝胶基质解冻后稀释在培养基中，进行冷藏处理，解冻后，使用移液器将基底膜提取物放入培养基中，用dmem培养基稀释基底膜提取物，稀释比例为1:80，获得ecm凝胶基质；将1:80稀释的ecm凝胶基质加入6孔板的每个孔中，旋转培养板，以使ecm凝胶基质均匀地铺展在板的表面上，并将其存放在2-8℃的环境中冷藏过夜至少2小时，或用保鲜膜将ecm凝胶基质包被，并储存于2-8℃环境中；将玻连蛋白在室温下解冻，并在无菌聚丙烯管中制备等分试样，将等分试样冷冻保存，解冻后将pbs缓冲液与玻连蛋白轻轻混合，以1:100比例稀释玻连蛋白，向6孔板的每个孔中加入稀释的玻连蛋白，并包被室温下孵育1小时；无菌环境中取出基础培养基，并向基础培养基中加入水乳蛋白补剂，将培养基等分成培养1周所需的体积，使用前，将基础培养基温热至室温程度后，避免光照将培养基在室温下放置；
将装有诱导性多能干细胞的冷冻管置于37℃的水浴中，解冻细胞，在水浴中轻轻旋转冷冻管，打开前用70％乙醇或等效消毒剂对冷冻管进行消毒，用5 ml无菌移液管，将冷冻保护剂以及细胞混合物从冷冻管转移到离心管中，在室温下，缓慢地逐滴向离心管中加入适当的培养液，轻摇离心管，同时加入几滴培养液，并将细胞离心2分钟，去除并倒掉上清液；在接种细胞之前，将盛有ecm凝胶基质的板放回到室温下10-15分钟，除去包被溶液，然后每孔加入诱导性多能干细胞，培养5-10分钟后，将板上的细胞取出放入盛有氨基酸补剂的培养基中，同时加入玻连蛋白，培养一段时间后，将培养中的细胞提取放入离心管中，轻拍离心管，以使细胞沉淀脱离，使细胞均匀铺展在培养皿中，并加入培养液，在培养一段时间后获得分化后的造血干细胞。
20.实验例：结合实施例1~3中的内容，记录多能干细胞向造血干细胞分化过程中的细胞分化数量以及细胞分化速度。
21.以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。