本发明涉及中药制剂有效成分含量的检测方法，尤其涉及巴戟补肾丸有效成分含量的hplc检测方法，属于巴戟补肾丸有效成分含量的检测领域。
背景技术：
1、巴戟补肾丸是由制何首乌、巴戟肉、枸杞子、芡实、当归、牛膝等37味中药制成。方中制何首乌、巴戟肉、党参、狗脊、山药、芡实、肉苁蓉等诸药之性合用共奏补肾填精，益气养血之效，用于肾亏阳萎，头晕目眩，耳鸣，四肢酸软，腰膝酸痛。
2、巴戟补肾丸现标准收载于部颁标准中药成方制剂第十册的132页，其质量标准只有鉴别和检查项。为了有效地控制该产品质量，需要对巴戟补肾丸中有效成分的含量进行准确检测以提高巴戟补肾丸的质量检测标准。
技术实现思路
1、本发明的主要目的是提供一种准确度高、专属性强、灵敏度好的巴戟补肾丸中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷含量的hplc检测方法；
2、为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：
3、一种巴戟补肾丸中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷含量的hplc检测方法，包括：
4、(1)制备2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液；
5、(2)制备待检测的巴戟补肾丸供试品溶液；
6、(3)将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液、待检测的巴戟补肾丸供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行液相色谱检测，采用外标法计算得到待检测的巴戟补肾丸供试品溶液中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷的含量。
7、本发明的一种优选的具体实施方案，还包括：将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液梯度稀释后分别注入液相色谱仪进行液相色谱检测测定峰面积，以峰面积平均值为纵坐标、进样浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到回归方程；其中，所述的回归方程为：y＝39.10389x+13.84366；其中，y为峰面积平均值，x为样品进样浓度，单位为μg/ml；更优选的，将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液依次稀释得到252.4μg/ml，126.2μg/ml，63.10μg/ml，25.24μg/ml，12.62μg/ml，5.048μg/ml系列浓度溶液，分别吸取稀释的对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。
8、其中，进行液相色谱检测的色谱条件包括：
9、流动相为：乙腈和水；采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～30min，12％→22％乙腈，28％→78％水；30～32min，22％→12％乙腈,78％→88％水；32～38min，12％乙腈,88％水。
10、本发明一种优选的实施方案，在进行液相色谱检测时色谱柱优选使用十八烷基硅烷键合硅胶柱，流速设置为0.5-1.50ml/min；检测波长为320nm；柱温：20-30℃；进样量为5-15μl；更优选的，流速设置为1.00ml/min；检测波长为320nm；柱温：25℃；进样量为10μl。
11、本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中所述2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液的制备方法包括：将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷加入到稀乙醇中制成每1ml含25μg的对照品溶液，即得。
12、本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中待检测的巴戟补肾丸供试品溶液的制备方法包括：将巴戟补肾丸用乙醇或甲醇为提取溶剂，采用超声提取或加热回流提取得到提取液，将提取液滤过，取滤液，即得；其中，所述的乙醇可以为稀乙醇、70％乙醇或95％乙醇，优选为稀乙醇；所述的甲醇可以是50％甲醇、70％甲醇或100％甲醇，优选为70％甲醇。
13、本发明的一种优选实施方案，所述稀乙醇的配制方法为：取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得；在20℃含c2h5oh为49.5％～50.5％(ml/ml)。
14、方法学验证试验结果表明，本发明建立的巴戟补肾丸中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷含量的检测方法专属性强，具有良好的线性关系、重复性及再现性，加样回收率试验证明本发明检测方法具有较高的准确度。
1.一种巴戟补肾丸中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷含量的hplc检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的hplc检测方法，其特征在于，还包括：将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液梯度稀释后分别注入液相色谱仪进行液相色谱检测测定峰面积，以峰面积平均值为纵坐标、进样浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到回归方程。
3.根据权利要求2所述的hplc检测方法，其特征在于，将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液依次稀释得到252.4μg/ml，126.2μg/ml，63.10μg/ml，25.24μg/ml，12.62μg/ml，5.048μg/ml系列浓度溶液，分别吸取稀释的对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。
4.根据权利要求2所述的hplc检测方法，其特征在于，所述的回归方程为：y＝39.10389x+13.84366；其中，y为峰面积平均值，x为样品进样浓度，单位为μg/ml。
5.根据权利要求1或2所述的hplc检测方法，其特征在于，采用液相色谱检测时色谱柱使用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流速设置为0.5-1.50ml/min；检测波长为320nm；柱温：20-30℃；进样量为5-15μl。
6.根据权利要求5所述的hplc检测方法，其特征在于，流速设置为1.0ml/min；柱温：25℃；进样量为10μl。
7.根据权利要求1所述的hplc检测方法，其特征在于，步骤(1)所述2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液的制备方法包括：将2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷加入到稀乙醇中制成每1ml含25μg的对照品溶液，即得。
8.根据权利要求1所述的hplc检测方法，其特征在于，步骤(2)中待检测的巴戟补肾丸供试品溶液的制备方法包括：将巴戟补肾丸用乙醇或甲醇为提取溶剂，采用超声提取或加热回流提取得到提取液，将提取液滤过，取滤液，即得。
9.根据权利要求8所述的hplc检测方法，其特征在于，所述的乙醇为稀乙醇、70％乙醇或95％乙醇；所述的甲醇是50％甲醇、70％甲醇或100％甲醇。
10.根据权利要求7或9所述的hplc检测方法，其特征在于，按照体积比计，所述的稀乙醇的浓度是49.5-50.5％。
