本发明涉及一种异体肝细胞体外培养方法及其应用，涉及a61k，具体涉及医用配置品领域。
背景技术：
1、基于小分子重编程技术获得干细胞来源的肝前体样细胞，可以用于治疗重症肝病。随着技术的深入发展，免疫细胞治疗产品药物生产过程中尽量避免使用动物来源的材料，一方面可以减少来自于动物源材料的毒性，另一方面可以实现大规模的产业化生产。但是无动物源成分的培养基容错性较差，对培养基的特异性要求更高，并且无动物源成分的培养基易受到机械因素和化学因素的影响，不利于细胞的增殖分化，细胞生长缓慢，有限细胞系的传代次数也减少。因此开发一种可以多次传代的，且使用非动物来源的培养基的肝细胞体外培养方法至关重要。
2、发明专利wo2016197274a1公开了一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法，从人小涎腺组织体外分离培养出上皮干/祖细胞，并在上皮细胞培养基进一步培养扩增，之后在含生长因子的成肝诱导培养基中，通过平面培养或三维培养体系，诱导分化获得肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，是通过干细胞进行的肝细胞的增殖分化，干细胞的来源较少，成本较高。发明专利hk1188253a1公开了一种肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法，在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，但是培养基中需要添加动物或人细胞，产业化应用存在带来源于动物的病毒风险。
技术实现思路
1、为了开发一种可以多次传代的，且使用非动物来源的培养基的肝细胞体外培养方法，本发明的第一个方面提供了一种异体肝细胞体外培养方法，包括以下步骤：
2、s1获取肝细胞：将异体肝细胞接种至含培养基的培养皿中；
3、s2细胞传代：观察异体肝细胞的贴壁生长状态，待细胞汇合度达到80％以上，进行细胞传代操作。
4、作为一种优选的实施方式，所述培养基为ui-p培养基或py21培养基，所述培养基为无动物源原材料培养基。
5、作为一种优选的实施方式，所述步骤s1中异体肝细胞的接种密度为0.8×104-2.0×104个/cm2。
6、作为一种优选的实施方式，所述步骤s1中异体肝细胞来源于冻存肝细胞或新鲜分离原代肝细胞。
7、作为一种优选的实施方式，对所述冻存肝细胞复苏，其具体步骤如下：
8、m1：将冻存肝细胞放入37℃水浴锅中轻轻晃动2分钟至管内无明显冰晶；
9、m2：用酒精擦拭冻存管外表面，转生物安全柜中打开冻存管盖，移液器轻轻吹打管底2-3下，将细胞悬液转至装有10ml ui-p培养基的15ml离心管中，并用1ml ui-p培养基润洗冻存管；
10、m3离心，200g离心4-8min；
11、m4弃去上清液，用2ml ui-p培养基重悬细胞沉淀，取20μl细胞悬液加入20μl0.2％台盼蓝染色液，取混匀液20μl打入细胞计数板，用countstar计数仪计数；
12、m5取2个10cm培养皿，各自加入10ml ui-p培养基，每组条件接种1皿，接种密度2.0×104个/cm2。
13、作为一种优选的实施方式，所述细胞传代操作的具体方法包括如下步骤：
14、h1吸弃培养皿内培养上清液；
15、h2加入5ml缓冲液清洗,润洗一遍瓶底，吸弃洗液，重复一遍此操作；
16、h3加入5ml消化酶解液，培养箱中消化；
17、h4消化后得到圆形，透亮的细胞，从培养皿底脱落；
18、h5然后加入5ml缓冲液，形成细胞悬液，放入离心管；
19、h6离心，200g离心4-8min；
20、h7将离心后下层细胞沉淀用培养基重悬，混匀后，染色计细胞数；
21、h8接种至含10ml培养基的培养皿中，接种密度为2.0×104个/cm2，十字混匀；
22、h9转入培养箱培养，待细胞汇合度达到80％以上，传代处理。
23、作为一种优选的实施方式，当所述步骤s1中p0代异体肝细胞来源于新鲜分离原代肝细胞时，采用py21培养基，按(0.8-1.2)×104个/cm2密度接种。
24、作为一种优选的实施方式，所述步骤h9中培养箱的培养条件为37℃，1-10vol％co2，1-10vol％o2。
25、作为一种优选的实施方式，所述步骤h9中培养箱的培养条件为37℃，2-8vol％co2，2-8vol％o2。
26、作为一种优选的实施方式，所述步骤h9中培养箱的培养条件为37℃，5vol％co2，4-6vol％o2。
27、作为一种优选的实施方式，所述步骤h9中培养箱的培养条件为37℃，5vol％co2，5vol％o2。
28、作为一种优选的实施方式，所述步骤h7中计细胞数的方法为：取细胞悬液加入0.2％台盼蓝染色液中，混匀后取混匀液打入细胞计数板，用countstar计数仪计数。
29、作为一种优选的实施方式，所述缓冲液为pbs磷酸盐缓冲液。
30、作为一种优选的实施方式，所述步骤h3中消化条件为37℃，2-8vol％co2培养箱中消化5-10min。
31、作为一种优选的实施方式，所述步骤h3中消化条件为37℃，5vol％co2培养箱中消化5min。
32、作为一种优选的实施方式，所述步骤h9中存在生存缓慢的细胞，如果接种3天后细胞汇合度未达到80％，则更换培养基并记录，继续培养3天后细胞汇合度仍未达到80％，则终止培养。
33、发明人在进行肝细胞的体外培养的过程中发现，如果采用非动物来源的培养液作为培养基会导致肝细胞在体外培养基中生长缓慢，并且有限细胞系的传代次数会减少，无法满足细胞库的建立代次需求。发明人在实验过程中发现，细胞培养在低氧环境中可以延长细胞的传代次数，并且获得均一，立体的扩增细胞，收获数量较多的细胞。猜测可能的原因是：在低氧环境条件下，可以通过调节乏氧诱导因子来介导不同基因的表达，从而调节细胞的增殖。肝细胞的分裂能力相较干细胞本身欠佳，通过hif1α信号通路可以减缓肝细胞，在体外培养过程中的衰老，有利于维持细胞状态和促进增殖通过低氧的条件可以促进细胞的进一步分裂，增加肝细胞数量。
34、本发明的第二个方面提供了一种异体肝细胞体外培养方法的应用，应用于肝前体样细胞的获取。
1.一种异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述培养基为ui-p培养基或py21培养基，所述培养基为无动物源材料培养基。
3.根据权利要求1所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤s1中异体肝细胞的接种密度为0.8×104-2.0×104个/cm2。
4.根据权利要求1所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述细胞传代操作的具体方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤h9中培养箱的培养条件为37℃，1-10vol％co2，1-10vol％o2。
6.根据权利要求4所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤h7中计细胞数的方法为：取细胞悬液加入0.2％台盼蓝染色液中，混匀后取混匀液打入细胞计数板，用countstar计数仪计数。
7.根据权利要求4所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述缓冲液为pbs磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求4所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤h3中消化条件为37℃，2-8vol％co2培养箱中消化5-10min。
9.根据权利要求4所述异体肝细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤h9中存在生存缓慢的细胞，如果接种3天后细胞汇合度未达到80％，则更换培养基并记录，继续培养3天后细胞汇合度仍未达到80％，则终止培养。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述异体肝细胞体外培养方法的应用，其特征在于，应用于肝前体样细胞的获取。
