本发明属于分子生物学，具体涉及一种以平贝母its1序列为靶标、基于proofman-lmtia的平贝母成分快速检测方法、引物组、探针及其应用。
背景技术：
1、贝母类药材是贝母属植物的鳞茎，是我国传统中药材，药用历史悠久，具有止咳平喘等功效。其中川贝母更是我国名贵的重要中药材，2020年版《中国药典》一部中明确规定了川贝母的6种植物来源，分别为百合科贝母属植物川贝母fritillaria cirrhosad.don.、暗紫贝母fritillaria unibracteata hsiao et k.c.hsia.、甘肃贝母fritillariaprzewalskii maxim.、梭砂贝母fritillaria delavayi franch.、太白贝母fritillaria taipaiensisp.y.li或瓦布贝母fritillaria unibracteata hsiao etk.c.hsiavar.wabuensis(s y.tang et s c.yue)z.d.liu,s.wang et s.c.chen的干燥鳞茎。平贝母药材是百合科植物平贝母fritillaria ussuriensis maxim.的干燥鳞茎，植物来源与川贝母同科同属。平贝母的价格比川贝母低，并且小平贝的外观性状与川贝母中价格最高的松贝外观性状非常相近(https://www.kmzyw.com.cn/jiage/today_price_0087.html)，因此市场常有以平贝母掺伪川贝母的现象发生。因此，快速准确鉴定平贝母变得十分迫切。
2、2020版《中国药典》提供了性状、表面显微鉴别、薄层色谱鉴别、高效液相色谱(hplc)测定主要药效成分含量的方法，但这些方法在实际应用中都存在一些缺点，如性状鉴定主观性强、显微鉴定需要专门的显微镜、薄层层析鉴定需要昂贵的标准品、hplc法需要昂贵的仪器及专业操作。由于小平贝与川贝母中的松贝在形态上较为相似，并且当原药材打磨成粉末或作为原料加工成药品后，无法通过肉眼进行区分和鉴定。因此，迫切需要一种快速、成本低、不需要昂贵仪器、适合大众使用的平贝母快速鉴定方法。
3、为解决以上问题，陈士林院士等开发了一种主要基于dna条形码的药用植物中药材鉴定系统，该方法能够克服性状鉴定中的主观性缺陷，但仍需通过pcr技术扩增dna序列并进行dna测序和序列比对。该方法仍存在需要pcr、dna测序仪等昂贵仪器、专业操作人员和较长检测时间的问题。
4、2020版《中国药典》提供了川贝母的pcr-rflp(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)检测方法，未提供平贝母的pcr-rflp检测方法，所以不能检测川贝母中是否混有平贝母，并且pcr-rflp方法需要进行pcr扩增、酶切和电泳检测，需要价格较贵的pcr仪和较长的检测时间。
5、针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于proofman-lmtia技术的平贝母成分快速检测方法。该方法利用lmtia引物和proofman探针，在恒温条件下进行快速扩增反应，显著提高了检测的效率和灵敏度。与传统方法相比，本发明不仅简化了操作流程，降低了成本，而且大幅缩短了检测时间，具有广泛的应用前景。通过本发明的实施，可以有效地解决川贝母及其衍生产品在生产、加工和流通环节中是否掺假平贝母的问题，保障消费者健康权益，促进中医药产业的健康发展。
技术实现思路
1、针对现有平贝母检测技术的不足，本发明创新性地引入了ladder-shape meltingtemperature isothermal amplification(lmtia)技术(技术原理详见wang deguo,etal.ladder-shape melting temperature isothermal amplification ofnucleicacids.biotechniques,2021,71(1):358-369，或专利cn2020111054053、pct/cn2020/133584或cn117512195a)，并结合proofman探针，开发了一种快速、灵敏、特异的平贝母成分检测方法。该方法不仅有效地解决川贝母及其衍生产品在生产、加工和流通环节中是否掺假平贝母的问题，而且极大地简化了检测流程，降低了成本，缩短了检测时间。
2、本发明的核心在于设计了一套特异性针对平贝母its1序列的lmtia引物组和proofman探针。这些引物和探针的序列如下：
3、f1：5'-ccgcccgacacgttttagagaccgcgaacccgta-3'
4、b1：5'-tgcccgccctgcttttccccgcaaatcgtgtccg-3'
5、lb：5'-gtccgcgatcgcctcc-3'
6、probe：5'bhq1-gtccgcgatcgcctca-3'-6-fam。
7、本发明提供一种用于贝母及其衍生产品中平贝母成分检测的试剂盒，使得平贝母成分的检测更加便捷和标准化。所述试剂盒包含第一方面所述的引物组和探针。
8、本发明提供一种根据上述第一方面的lmtia引物组和proofman探针或上述第二方面的试剂盒在贝母及其衍生产品中平贝母成分检测中的应用。
9、本发明提供一种基于proofman-lmtia的平贝母及其衍生产品快速检测方法。取待检样品，提取样品基因组dna，采用权利要求1所述的lmtia引物组和proofman探针或权利要求2所述的试剂盒配制proofman-lmtia反应体系；将配制好的proofman-lmtia反应体系置于实时荧光定量pcr系统或其它等温设备中进行等温扩增，以检测样品中是否存在平贝母成分；在反应完成的样品检测管中，若在绿色荧光通道(fam)能够检测到荧光信号，并且扩增结果图中出现指数扩增曲线，则样品中含有平贝母成分；若在绿色荧光通道(fam)检测不到荧光信号，并且扩增结果图中无指数扩增曲线，则样品中不包含平贝母成分。
10、作为进一步优选的技术方案，proofman-lmtia反应体系中f1：b1：lb：probe的摩尔比为4：4：1：1。
11、作为进一步优选的技术方案，所述proofman-lmtia反应体系为10μl，组成成分为：5μl的2×mix预混液、0.4μl的dna聚合酶、0.16μl的引物f1(100μmol)、0.16μl的b1(100μmol)、0.04μl的环引物lb(100μmol)、0.4μl的probe(10μmol)、2μl的平贝母基因组dna模板、1.84μl的depc处理水
12、作为进一步优选的技术方案，所述2×mix预混液的组成成分为：40mmol tris-hcl(ph 8.8,25℃)，20mmol kcl，20mmol(nh4)2so4，12mmol mgso4，整个反应体系汇中体积占比0.2％的triton x-100，2.4mmol dntp。
13、作为进一步优选的技术方案，所述等温扩增的温度为66℃，每30s采集一次荧光信号，共采集40次荧光信号。
14、本发明的有益效果包括：
15、本发明的用于检测平贝母成分的proofman-lmtia引物组、探针具有良好的特异性和灵敏度，检测速度快，在恒温条件下即可实现对样品中平贝母成分的准确检测。
16、本发明的用于检测平贝母成分的lmtia检测的方法简单、快捷，在等温条件下扩增20分钟即可实现样品中平贝母成分的快速精准检测，并具有较好的重复性和较高的稳定性。
17、本发明的lmtia引物组和proofman探针在66℃时特异性最佳。
18、本发明的lmtia引物组和proofman探针的绝对灵敏度可达1pg/μl平贝母基因组dna。
19、本发明的lmtia引物组和proofman探针可用于平贝母种子、种苗、根茎、饮片、含平贝母成分的药品检测。
1.用于平贝母检测的lmtia引物组和proofman探针，其特征在于，所述引物组和探针以平贝母its1为靶序列，其中，
2.用于平贝母成分检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和探针。
3.如权利要求1所述的lmtia引物组和proofman探针或权利要求2所述的试剂盒在平贝母种子、种苗、根茎、饮片、含平贝母成分的药品检测中的应用。
4.一种基于proofman-lmtia的平贝母快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的基于proofman-lmtia的平贝母快速检测方法，其特征在于：所述proofman-lmtia反应体系中f1：b1：lb：probe的摩尔比为4：4：1：1。
6.根据权利要求5所述的基于proofman-lmtia的平贝母快速检测方法，其特征在于，所述proofman-lmtia反应体系为10μl，组成成分为：5μl的2×mix预混液、0.4μl的dna聚合酶、0.16μl的引物f1、0.16μl的b1、0.04μl的环引物lb、0.4μl的probe、2μl的平贝母基因组dna模板、1.84μl的depc处理水。
7.根据权利要求6所述的基于proofman-lmtia的平贝母快速检测方法，其特征在于，所述2×mix预混液的组成成分为：40mmol tris-hcl，20mmol kcl，20mmol(nh4)2so4，12mmolmgso4，0.2％triton x-100，2.4mmol dntp。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的基于proofman-lmtia的平贝母快速检测方法，其特征在于：所述等温扩增的温度为66℃，每30s采集一次荧光信号，共采集40次荧光信号。
