本发明涉及一种提高α-琼胶酶热稳定性的突变体及其应用，属于基因工程和酶工程。
背景技术：
1、海洋藻类因其可作为食物、材料和可再生能源来源而受到人们的广泛关注，在所有商业藻类中，产量最大的是红藻。琼脂是红藻细胞壁的主要成分，通常作为增稠剂与胶凝剂应用。在食品工业中，附加值较低。而从琼脂中提取的寡糖则具有多种有益的生物活性，包括抗炎、抗氧化、益生、抑菌和美白皮肤等，使得琼胶寡糖在食品、医药、农业等领域均具有应用潜力，极大的提高了琼脂的经济效益。
2、酶法由于能特异性水解琼脂，并且不形成有害化合物的优点，被认为是可持续的商业化生产琼胶低聚糖的主要方法。然而，目前我国的琼胶酶研究尚处于起步阶段，其中α-琼胶酶与β-琼胶酶相比，品类少，结构复杂，热稳定性普遍较差，严重阻碍了α-琼胶酶的大规模应用。现有技术中的α-琼胶酶包括alteromonas agarlyticus gj1b来源的agaa、thalassomonas sp.44jamb-a3来源的agaa33、thalassomonas sp.ld5来源的agad与agae、catenovulum agarivorans来源的calj96、catenovulum sediminis ws1-a来源的agaws5、gilvimarinus agarilyticus来源的ouc-gajj96、colwellia echini a3t来源的ce2834和ce2835以及catenovulum maritimum stb14来源的cm-aga，其中热稳定性差的的问题普遍存在，难以满足工业生产需要。
3、本发明选用catenovulum agarivorans stb13来源的ca-aga，是目前实验室表达酶活最高的α-琼胶酶，且具有强底物特异性，可生产不同聚合度的琼胶寡糖，具有巨大的应用潜力。然而天然来源的琼胶酶绝大多数热稳定性较差，这极大限制了琼胶酶的水解效率和实际工业化应用。因此，通过基因工程和酶工程等手段提高α-琼胶酶ca-aga的热稳定性，对于α-琼胶酶的定向分子改造与高效率、低成本的琼脂加工具有重要意义。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明通过对来源于海洋微生物噬琼胶卵链菌catenovulumagarivorans stb13的α-琼胶酶进行定向分子改造，得到一系列热稳定性显著提升的突变体，且这些α-琼胶酶突变体的酶活相对于野生型还略有提升，更适用于工业化生产。
2、本发明的第一个目的是提供一种α-琼胶酶突变体，所述α-琼胶酶突变体通过seqid no.1所示的氨基酸序列或与其同源性不低于90％的序列突变得到，所述的突变包括以下任一种或其组合：
3、将第467位的天冬氨酸突变为丝氨酸；
4、或将第470位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
5、或将第470位的天冬酰胺突变为丝氨酸。
6、进一步地，编码野生型酶的基因序列如seq id no.2所示。
7、本发明的第二个目的是提供编码所述α-琼胶酶突变体的核酸分子。
8、本发明的第三个目的是提供携带所述核酸分子的重组表达载体。
9、进一步地，载体可根据需要(如宿主种类)进行选择，包括但不限于pet系列质粒。
10、本发明的第四个目的是提供含有所述核酸分子的表达框。
11、进一步地，所述表达框包括表达所述核酸分子必要的原件和/或辅助表达的原件，如启动子、终止子、信号肽、rbs等。
12、本发明的第五个目的是提供表达所述α-琼胶酶突变体的重组细胞。
13、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞包括微生物(真菌或细菌)，如常见的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等。
14、本发明的第六个目的是提供一种生产α-琼胶酶突变体的方法，包括采用所述重组细胞进行发酵生产的步骤。
15、本发明的第七个目的是提供所述α-琼胶酶突变体、核酸分子、重组表达载体、表达框或重组细胞在水解琼脂中的应用。
16、进一步地，所述应用包括，以α-琼胶酶突变体或重组细胞为催化剂，催化琼脂转化为以3，6-内醚-α-l-半乳糖为还原性末端的琼寡糖。
17、本发明的有益效果：
18、本发明提供了一种提高α-琼胶酶热稳定性的突变体，其中野生型α-琼胶酶来源于海洋微生物噬琼胶卵链菌catenovulum agarivorans stb13，本发明通过对突变位点进行筛选，最终确定398、467和470位为待改造位点，分别进行突变后，发现不同突变体的酶活仍能保持与野生型相当的酶活，且部分突变体的热稳定性有不同程度的提升，最优突变体的热稳定性相比野生型提高了1.32倍。本发明提供的α-琼胶酶突变体可以更适应温度的变化，生产琼寡糖。
1.一种α-琼胶酶突变体，其特征在于，所述α-琼胶酶突变体通过seq id no.1所示的氨基酸序列或与其同源性不低于90％的序列突变得到，所述的突变包括以下任一种或其组合：
2.编码权利要求1所述α-琼胶酶突变体的核酸分子。
3.携带权利要求2所述核酸分子的重组表达载体。
4.含有权利要求2所述核酸分子的表达框。
5.根据权利要求4所述的表达框，其特征在于，所述表达框包括表达所述核酸分子必要的原件和/或辅助表达的原件。
6.表达权利要求1所述α-琼胶酶突变体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞包括微生物。
8.一种生产α-琼胶酶突变体的方法，其特征在于，包括采用权利要求6或7所述重组细胞进行发酵生产的步骤。
9.权利要求1所述α-琼胶酶突变体、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4或5所述表达框或权利要求6或7所述重组细胞在水解琼脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以α-琼胶酶突变体或重组细胞为催化剂，催化琼脂转化为以3，6-内醚-α-l-半乳糖为还原性末端的琼寡糖。
