本发明涉及光催化剂领域，具体涉及一种基于cdse量子点的适用革兰氏阳性菌的光合生物杂化系统构建方法。
背景技术：
1、目前世界上主要的能源形式以石油、煤炭、天然气为主，大量的化石能源消费，引起温室气体排放，使大气中温室气体浓度增加、温室效应增强，导致全球气候变暖。化石能源，特别是煤炭的使用带来大量的二氧化硫和烟尘排放，也是造成我国大气污染的主要来源。基于此，寻求可再生的绿色能源，代替化石燃料的应用已成为未来发展的必然趋势。太阳能已被视为地球上最丰富、最有前途的可再生能源，并将在未来能源结构中发挥最重要的作用。太阳能是可再生的清洁能源，有助于减少对化石燃料的依赖和减轻环境污染。然而，无论纯人工还是纯生物的方法目前都无法直接实现太阳能到化学物质的转化。
2、光催化材料能直接利用太阳能，具有可持续性。光催化材料能够模仿天然生物吸光色素，对太阳光谱的吸收更广、对太阳光谱的分段互补吸收、更容易电荷分离,因此捕光效率更高。cdse量子点是一种介于2.0-0.4nm的超小纳米粒子，具有广泛的应用前景，包括生物医学、太阳能电池和光电器件的制造。此外，cdse量子点具备良好的生物相容性，有助于在不影响细胞正常功能的情况下进行标记和成像，已成为微生物光敏化的理想候选者而被引入细菌中构建无机-生物杂化系统。然而，通过研究发现，目前所有关于cdse量子点生物合成的报道中所利用的微生物均为体内具有天然的谷胱甘肽代谢途径的革兰氏阴性菌和某些酵母菌。本发明提出一种基于cdse量子点的适用革兰氏阳性菌的光合生物杂化系统构建方法，有望突破cdse量子点的发展与应用局限。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于cdse量子点的适用革兰氏阳性菌的光合生物杂化系统构建方法，以现代生物技术为手段，通过引入谷胱甘肽合成途径诱导胞内cdse的生物合成，构建cdse-革兰氏阳性菌杂化体系，在可见光下强化细菌胞内nadh的再生，进一步促进胞内产物的代谢通量；所述杂化体系将丰富而廉价的太阳能通过微生物细胞工厂转化为工业化产品，将是解决能源短缺和环境恶化双重危机的有效途径。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种基于cdse量子点的适用革兰氏阳性菌的光合生物杂化系统构建方法，包括如下步骤：
4、(1)谷胱甘肽合成途径的引入：设计gsha和gshb的扩增引物，实现gsha和gshb在革兰氏阳性菌中过表达，赋予革兰氏阳性菌合成谷胱甘肽的能力，获得重组菌株；
5、(2)cdse-菌杂化体系的构建：将重组菌株过夜培养，转接至新鲜的培养基中继续培养4-6小时，加入亚硒酸钠和氯化镉培养12-24小时即合成有荧光显色的cdse量子点，获得cdse-菌杂化体系。
6、步骤(1)中gsha的扩增引物为：
7、gsha-f：ttgatcccggacgtatcacaggcgctggc，
8、gsha-r：tcaggcgtgtttttccagccacaccgcaaac；
9、gshb的扩增引物为：
10、gshb-f：atgatcaagctcggcatcgtgatggacccca，
11、gshb-r：ttactgctgctgtaaacgtgcttcgatggcatc。
12、步骤(1)中gsha和gshb基因来源于大肠杆菌基因组。
13、步骤(1)中所述革兰氏阳性菌为丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌或者丁酸梭菌。
14、步骤1)中将gsha和gshb克隆至已被线性化的载体pimp1-pthl的kpni位点获得重组质粒pimp1ab-pthl，随后在大肠杆菌top10(pan1)中进行甲基化再通过电转化的方式使gsha和gshb在革兰氏阳性菌中分别获得表达。
15、步骤(2)中所述亚硒酸钠添加量为0.5-2mm；所述氯化镉添加量为0.3-1mm。
16、cdse量子点的荧光显色为亮黄色。
17、上述的构建方法构建得到一种cdse-革兰氏阳性菌杂化体系。
18、所述的cdse-革兰氏阳性菌杂化体系在生产丁醇中的应用。
19、优选地，革兰氏阳性菌为丙酮丁醇梭菌。
20、一种cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系的构建方法，包括如下步骤：
21、(1)谷胱甘肽合成途径的引入:设计gsha和gshb的扩增引物，以大肠杆菌基因组dna为模板进行gsha和gshb的扩增。采用一步克隆试剂盒将gsha和gshb克隆至已被线性化的载体pimp1-pthl的kpni位点获得重组质粒pimp1ab-pthl，随后在大肠杆菌top10(pan1)中进行甲基化再通过电转化的方式使gsha和gshb在丙酮丁醇梭菌中分别获得表达。
22、(2)cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系的构建：将重组菌株过夜培养，转接至新鲜的培养基中继续培养4-6小时，加入亚硒酸钠和氯化镉培养12-24小时即合成有亮黄色的cdse量子点，获得cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系。
23、步骤(1)中将重组菌株过夜培养后取适量的细胞培养物利用细胞破碎仪进行破碎，离心收集上清进行sds-page检测，进行gsha和gshb的蛋白表达分析。
24、步骤(2)中加入亚硒酸0.5-2mm和氯化镉0.3-1mm。
25、优选的，步骤(2)中加入亚硒酸1mm和氯化镉1mm。
26、对cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系进行理化性质的表征：
27、对杂化体系的理化性质进行stem，xrd，ftir等表征的分析，stem图像表明细胞胞内两端均分布着团聚的cdse量子点，结果如图1所示。xrd衍射显示出三个主要的衍射峰，分别对应于cdse量子点的(111)、(220)和(311)，同时取600μl的菌液在紫外灯下照射发现有明显的荧光，结果如图2所示。ftir光谱里观察到在1630cm-1和1540cm-1有两个红外吸收带，这与蛋白质分子酰胺i和酰胺ii带的弯曲振动有关，暗示了有蛋白质分子(谷胱甘肽)在cdse量子点外的包封，进一步印证了cdse量子点的合成与谷胱甘肽有关，结果如图3所示。
28、所述的构建方法构建得到一种cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系在生产丁醇中的应用。
29、将收集的丙酮丁醇梭菌杂化体系接种于营养培养基中，1000-3000w/m2可见光条件下进行发酵生产丁醇。
30、将丙酮丁醇梭菌杂化体系接种于cgm培养基中，在37℃、180rpm、1000-3000w/m2可见光条件下的发酵30～96小时。
31、本发明一个实施例中，将丙酮丁醇梭菌杂化体系接种于cgm培养基中，在37℃、180rpm、2000w/m2可见光条件下的发酵72小时，相较于单独的丙酮丁醇梭菌，杂化体系在以55g/l葡萄糖为碳源的基础上，光照条件下丁醇浓度为16.18g/l，丁醇收益为0.29g/g，分别提高了37.8％和26.1％。
32、cgm培养基为：55g/l葡萄糖，15.0g/l蛋白胨，1.0g/l淀粉，5.0g/l氯化钠，4.0g/l磷酸氢二钾，1.0g/l磷酸二氢钾，10.0g/l琼脂。
33、有益效果：
34、本发明利用遗传操作技术赋予丙酮丁醇梭菌谷胱甘肽的合成能力介导胞内cdse的生物合成，构建的cdse-丙酮丁醇梭菌光合生物杂化系统可应用于革兰氏阳性菌，有望突破cdse量子点生物合成的发展及应用的限制。
35、本发明提出将丙酮丁醇梭菌与无机光催化材料cdse结合的策略，构建cdse-丙酮丁醇梭菌杂化体系，有望利用可再生能源强化丙酮丁醇梭菌的生产力，为丁醇、丁酸、氢气等高附加值产品的绿色生产提供方法基础。
1.一种基于cdse量子点的适用革兰氏阳性菌的光合生物杂化系统构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中gsha的扩增引物为：
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中gsha和gshb基因来源于大肠杆菌基因组。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述革兰氏阳性菌为丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌或者丁酸梭菌。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中将gsha和gshb克隆至已被线性化的载体 pimp1-pthl的kpni位点获得重组质粒 pimp1ab-pthl，随后在大肠杆菌top10（pan1) 中进行甲基化再通过电转化的方式使gsha和gshb在革兰氏阳性菌中分别获得表达。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2） 中所述亚硒酸钠添加量为0.5-2 mm。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2） 中所述氯化镉添加量为0.3-1 mm。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）cdse量子点的荧光显色为亮黄色。
9.权利要求1至7中任意一项所述的构建方法构建得到一种cdse-革兰氏阳性菌杂化体系。
10.权利要求8所述的cdse-革兰氏阳性菌杂化体系在生产丁醇中的应用。
