本发明涉及多肽合成领域，特别是一种促进伤口愈合小肽的制备方法工业化
背景技术：
1、本发明所制备的促进伤口愈合的小肽，分子式为c43h57n13o13，相对分子质量为964.01，其序列为ydwpggrn（h-tyr-asp-trp-pro-gly-gly-arg-asn-oh）；由南京财经大学沈新春团队首次从小麦胚芽蛋白活性肽中筛选出来的，其专利号为2019112582186。所述的小肽具有促进伤口愈合的效果，可以做为治疗皮肤损伤的药品和护肤产品的一种活性成分，具有非常广阔的商业应用前景。
2、本发明制备的促进伤口愈合的小肽，是从小麦胚芽蛋白活性肽中筛选出来的，但是以小麦胚芽蛋白为原料来规模化制备还是存在难以解决的技术难题，因此其规模化制备的问题急需解决。
3、现有技术通常可以采用化学法来规模化制备多肽。多肽的化学法制备有boc法和fmoc法，其中boc法中要用到腐蚀性极强的hf气体，对生产环境和生产设备的要求很高；fmoc法所用试剂和原料容易大量获得、环境友好，选择此策略较好。
4、本发明利用fmoc法对一种促进伤口愈合的小肽的制备方法进行了研究，从而得到本技术方案。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是提供一种促进伤口愈合小肽的工业化制备方法。本发明通过fmoc化学法规模化制备一种促进伤口愈合的小肽，生产成本低，纯度高，完全保持了天然结构小肽的生物活性，可以规模化工业生产。
2、为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
3、一种促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，包括如下步骤：
4、（a）、采用固相载体y树脂与fmoc-x-oh反应得到fmoc-x-y树脂。
5、（b）、fmoc-x-y树脂经脱fmoc后，依次与fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、boc-tyr(tbu)-oh偶联反应，得到肽树脂：boc-tyr(tbu)-asp(otbu)-trp(boc)-pro-gly-gly-arg(pbf)-x-y树脂。
6、（c）、肽树脂经裂解、纯化、冻干，得到精肽: h-tyr-asp-trp-pro-gly-gly-arg-asn-oh。
7、（d）、合成的小肽进行活性测定。
8、优选的，步骤（a）中固相载体y树脂为wang-树脂、ctc-树脂、rink amide-树脂、rink amide-am-树脂、sieber-树脂的一种，fmoc-x-oh为fmoc-asn(trt)-oh和fmoc-asp(otbu)-oh中的一种；更为优选的所述固相载体为替代度为0.3-1.0mmol/g；更为优选的fmoc-x-y树脂制备方法为：fmoc-asn(trt)-oh与wang-树脂偶联得到fmoc-asn(trt)-wang-树脂；fmoc-asn(trt)-oh与ctc-树脂偶联得到fmoc-asn(trt)-ctc-树脂；fmoc-asp-otbu与rink amide-树脂偶联得到fmoc-asp(rink amide-树脂)-otbu；fmoc-asp-otbu与rinkamide am-树脂偶联得到fmoc-asp(rink amide am-树脂)-otbu；fmoc-asp-otbu与sieber-树脂偶联得到fmoc-asp(sieber-树脂)-otbu。
9、优选的，步骤（b）所述的偶联反应，均是缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以kaiser试剂检测反应终点。更进一步优选的，步骤（b）中，所述偶联反应中所用的缩合剂为以下组合dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/dipea、hbtu/hobt/dipea、hatu/hoat/dipea的一种。
10、优选的，步骤（c）中所述裂解用的裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的tfa溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和tis中的一种或几种。
11、优选的，步骤（d）中所述活性测定方法为：测定合成小肽对小鼠成纤维细胞l929和人永生化表皮细胞hacat的增殖作用；更进一步优选的，其活性测定方法为：小肽精肽按照终浓度为5μm、20μm、80μm溶于rpmi 1640培养液中,用mtt法检测小肽ydw对小鼠成纤维细胞l929和人永生化表皮细胞hacat增殖活性的影响。具体方法如下:将人永生化表皮细胞hacat(湖南丰晖生物科技有限公司)和小鼠成纤维细胞l929(湖南丰晖生物科技有限公司),分别采用含有10%(体积百分浓度)fbs(胎牛血清)的rpmi 1640培养液配置成5x104个细胞/ml的细胞悬液。将100μl细胞悬液添加至96孔板的每个试验孔中,在co2培养箱中培养12小时以粘附细胞,设置以rpmi 1640培养液替代细胞悬液的空白组。细胞附着后,除去培养液,将5μm、20μm和80μm小肽ydw溶液(小肽ydw溶液是将小肽ydw溶于添加有10%fbs的rpmi1640培养液后得到的)分别添加至试验孔中,每孔100μl每个浓度的小肽ydw溶液设置6个平行。空白组中也加入了不同浓度的小肽溶液;另设对照组,添加相同体积的rpmi 1640替代小肽ydw溶液,其他同试验组。然后,将96孔板在co2,培养箱中继续培养24h,向每个孔中添加10μl、5mg/ml的mtt(噻唑蓝)溶液,在co2,培养箱中培养4 h后,除去每孔中液体,再加入50l的dmso(二甲基亚砜),在37°c恒温器中震荡培养20min,使用酶标仪测量570n下的吸光度。根据细胞增殖活力=(od:-od)/(od照-od:)x100%来计算细胞增殖活力。
12、相对于现有技术，本发明的有益效果是：
13、本发明首次采用fmoc化学法制备促进伤口愈合的小肽，生产成本低，活性高，可以作为活性成分应用于药品和医美产品中。与现有技术中的制备方法相比，本发明能够有效的提高精肽的纯度，降低纯化的难度，有利于合成规模的放大，降低生产成本。
1.一种促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（a）中固相载体y树脂为wang-树脂、ctc-树脂、rink amide-树脂、rink amide-am-树脂、sieber-树脂的一种，fmoc-x-oh为fmoc-asn(trt)-oh和fmoc-asp(otbu)-oh中的一种。
3.根据权利要求2所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，固相载体的替代度为0.3-1.0mmol/g。
4.根据权利要求1所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（a）中的fmoc-x-y树脂制备方法为：fmoc-asn(trt)-oh与wang-树脂偶联得到fmoc-asn(trt)-wang-树脂；fmoc-asn(trt)-oh与ctc-树脂偶联得到fmoc-asn(trt)-ctc-树脂；fmoc-asp-otbu与rink amide-树脂偶联得到fmoc-asp(rink amide-树脂)-otbu；fmoc-asp-otbu与rink amide am-树脂偶联得到fmoc-asp(rink amide am-树脂)-otbu；fmoc-asp-otbu与sieber-树脂偶联得到fmoc-asp(sieber-树脂)-otbu。
5.根据权利要求1所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（b）所述的偶联反应，均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以kaiser试剂检测反应终点。
6.根据权利要求5所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（b）中，所述偶联反应中所用的缩合剂为以下组合dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/dipea、hbtu/hobt/dipea、hatu/hoat/dipea的一种。
7.根据权利要求1所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（c）中所述裂解用的裂解试剂为：体积比1-5%清除剂的tfa溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和tis中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，步骤（d）中所述活性测定方法标准为：测定合成小肽对小鼠成纤维细胞l929和人永生化表皮细胞hacat的增殖作用。
9.根据权利要求8所述的促进伤口愈合小肽的工业化制备方法，其特征在于，其具体活性测定方法为：小肽精肽按照终浓度为5μm、20μm、80μm溶于rpmi 1640培养液中，用mtt法检测小肽ydw对小鼠成纤维细胞l929和人永生化表皮细胞hacat增殖活性的影响；
