本发明涉及一种固定化酶制备方法，固定化酶及其在d-塔格糖制备中的应用，属于酶工程。
背景技术：
1、d-塔格糖是一种低热量的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的92％，但仅有38％的卡路里。d-塔格糖具有预防肥胖、降血糖、防龋齿、益生等诸多生理功能，可应用于烘焙食品、健康棒、牛奶饮料和糖果等食品生产过程中。
2、目前，单一酶法是酶法合成d-塔格糖的主要方式，如l-阿拉伯糖异构酶可催化d-半乳糖合成d-塔格糖；d-塔格糖3-差向异构酶和d-阿洛酮糖3-差向异构酶可转化d-山梨糖生成d-塔格糖；半乳糖醇2-脱氢酶可以d-半乳糖醇为底物，实现d-塔格糖的合成。但是由于底物昂贵而缺乏工业应用价值。最近，以麦芽糊精、纤维素或蔗糖为底物，经过多步酶催化转化，可一步合成d-塔格糖，具有潜在的应用价值。
3、在d-塔格糖的生物催化制备中，主要有以下研究：
4、专利cn 117327684 a公开了以淀粉为底物，以α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、塔格糖6-磷酸差向异构酶和塔格糖6-磷酸磷酸酶在体外酶催化生产塔格糖，但是该方案存在以下问题：1)反应时间长，催化时间长达24h，单位时间产率低；2)酶无法得到有效分离，导致重复利用度低。
5、专利wo 2023/279565 a1公开了以淀粉为底物，以硅藻土固定化基因工程菌生产塔格糖，但是该方案存在以下问题：1)以重组菌进行发酵生产塔格糖会导致微生物发酵产生的代谢产物污染，分离困难；2)该方案需要分别制备不同的重组菌，且需要高温干燥，工艺繁琐，增加生产成本。
6、综上，提供一种工艺简单，生产时间短，可分离回收利用的酶法d-塔格糖生产方法具有迫切的需求，但是现有技术尚无相关研究。
技术实现思路
1、[技术问题]
2、本发明要解决的技术问题是：提供一种工艺简单，生产时间短，可分离回收，酶活回收率高的固定化酶制备方法，利用该方法制备得到的固定化酶及其在d-塔格糖生产中的应用。
3、[技术方案]
4、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
5、本发明的第一个目的是提供一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
6、(a)将金属离子与载体混合，得到磁化载体，将所述磁化载体与含多官能胺试剂混合，反应，得到含氨基的磁化载体；所述金属离子包括fe3+和co2+；
7、(b)将酶与交联剂混合反应，得到酶偶联物；
8、(c)充分混合所述含氨基的磁化载体与所述酶偶联物，得到固定化酶；
9、所述酶包括：α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、果糖6-磷酸4-差向异构酶和磷酸酶。
10、在一种实施方式中，所述含多官能胺试剂包括以下至少一种：聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺或含有或不含有n-乙烯基甲酰胺的1-氨基乙烯的聚合物、脱乙酰壳多糖、白蛋白、明胶、亚精胺、精胺、三亚乙基四胺、聚丙烯亚胺树状高分子、双(2-乙基氨基)-1，3-丙二胺。
11、在一种实施方式中，所述含多官能胺试剂为聚乙烯亚胺。
12、在一种实施方式中，所述含多官能胺试剂的添加量为2.5％～5.5％(m/v)。
13、在一种实施方式中，所述交联剂选自戊二醛、聚氮杂环丁烷、氰尿酰氯、二环氧化物、二异氰酸酯中的至少一种。
14、在一种实施方式中，所述交联剂为戊二醛。
15、在一种实施方式中，所述交联剂的添加量为0.01％～0.1％(m/v)。可选为0.03％～0.05％(m/v)。
16、在一种实施方式中，所述载体选自皂土、矾土、硅藻土、高岭土中的至少一种。
17、在一种实施方式中，所述载体为硅藻土。
18、在一种实施方式中，所述硅藻土的添加量为1％～6％(m/v)。可选为3％(m/v)。
19、在一种实施方式中，所述步骤(a)具体包括：
20、步骤1，将所述fe3+和co2+与液体介质混合，调节ph为10～14，加入载体，进行共沉淀反应，分离固体沉淀物，得到磁化载体；所述载体添加量为1％～6％(m/v)；
21、步骤2，将步骤1所得磁化载体分散于含多官能胺试剂的液体介质，氨化所述磁化载体，得到含氨基的磁化载体。
22、在一种实施方式中，步骤1所述反应条件为：在70～90℃下搅拌20-40分钟，在60～80℃下静置陈化4～8h。
23、在一种实施方式中，所述fe3+和co2+的摩尔比为(1～5)：1，可选为23：12。
24、在一种实施方式中，所述步骤(b)具体包括：将交联剂与含酶液体介质混合，反应，得到酶偶联物；所述交联剂的添加量为0.01％～0.1％(m/v)。
25、在一种实施方式中，所述酶的添加量为500～4000u/g磁化载体。
26、在一种实施方式中，所述酶通过以下方法制备得到：
27、(1)将重组菌接种于种子培养基，培养得到种子液；
28、(2)将步骤(1)所得种子液转接于发酵培养基，发酵，收集菌体，破碎，得到所述酶；
29、所述出发菌株过表达了α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖6-磷酸异构酶和果糖6-磷酸4-差向异构酶和磷酸酶。
30、在一种实施方式中，所述α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、果糖6-磷酸4-差向异构酶和磷酸酶分别具有ncbi登录号ack43076.1，bad42440.1，baw02148.1，wp_014433578.1，wp_012940213.1所示的氨基酸序列。
31、在一种实施方式中，所述重组菌敲除了基因组上的pfka和zwf基因。
32、在一种实施方式中，所述pfka、zwf基因的gene id分别为948412、946370。
33、在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株。可选为大肠杆菌bl21。
34、在一种实施方式中，所述发酵具体包括：30～37℃培养至od600为0.6～0.8后，加入终浓度0.1～1mmol/l的iptg，20～25℃诱导6～10h。
35、在一种实施方式中，所述步骤(c)具体包括：充分混合所述含氨基的磁化载体与所述酶偶联物，于10℃～30℃下震荡反应，干燥，得到固定化酶。
36、在一种实施方式中，步骤(c)所述震荡反应的时间为3～12h。
37、本发明的第二个目的是提供上述任一所述方法制备得到的固定化酶。
38、本发明的第三个目的是提供一种生产d-塔格糖的方法，将所述固定化酶与麦芽糊精混合反应。
39、在一种实施方式中，所述麦芽糊精浓度为100～200g/l。
40、在一种实施方式中，所述反应的ph为7.5～8.0。
41、在一种实施方式中，所述反应温度为60～70℃。
42、在一种实施方式中，所述反应时间3～6h。
43、本发明的第四个目的是提供上述任一所述的方法，或上述固定化酶在d-塔格糖生产中的应用。
44、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
45、有益效果：
46、(1)本发明以硅藻土为基底，通过与fecl3和cocl2共沉淀一步得到磁性硅藻土载体，通过共固定化α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、果糖6-磷酸4-差向异构酶和磷酸酶，得到了磁性固定化酶。该固定化酶不仅具有高酶活，而且能够进行磁响应，在外部磁场环境下，能够进行磁回收。以价格低廉的麦芽糊精为底物，利用该固定化酶催化，能够一步法生成高附加值的d-塔格糖。此外，该固定化酶具有优异的操作稳定性，重复使用8批次后，活性仍保留到原始活性的71.3％左右，显示了其在工业应用中的巨大潜力。
47、(2)本发明的固定化酶制备方法具备显著提升的酶活回收率，本发明所述方法在保证了磁性为13.38emu/g的条件下，酶活回收率达到了43.49％，显著高于不交联的方案(酶活回收率3.62％)，同时显著高于利用亚铁离子制备磁性载体进行固定化的方案(酶活回收率15.05％)。
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含多官能胺试剂包括以下至少一种：聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺或含有或不含有n-乙烯基甲酰胺的1-氨基乙烯的聚合物、脱乙酰壳多糖、白蛋白、明胶、亚精胺、精胺、三亚乙基四胺、聚丙烯亚胺树状高分子、双(2-乙基氨基)-1，3-丙二胺。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、聚氮杂环丁烷、氰尿酰氯、二环氧化物、二异氰酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述载体选自皂土、矾土、硅藻土、高岭土中的至少一种。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)具体包括：
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括：将交联剂与含酶液体介质混合，反应，得到酶偶联物；所述交联剂的添加量为0.01％～0.1％(m/v)。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)具体包括：充分混合所述含氨基的磁化载体与所述酶偶联物，于10℃～30℃下震荡反应，干燥，得到固定化酶。
8.权利要求1～7任一所述方法制备得到的固定化酶。
9.一种生产d-塔格糖的方法，其特征在于，将权利要求8所述固定化酶与麦芽糊精混合反应。
10.权利要求1～7任一所述的方法，或权利要求8所述固定化酶，或权利要求9所述的方法在d-塔格糖生产中的应用。
