本发明涉及一种合成次丹参酮二烯菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
1、次丹参酮二烯是鼠尾草酸等松香烷类二萜的生物合成中间体，广泛存在于药用植物中。当前，次丹参酮二烯的生物合成途径已经得到解析，包括甲羟戊酸(mva)途径或甲基赤藓糖磷酸(mep)途径合成二萜前体香叶基香叶基焦磷酸，随后在二型二萜合酶和一型二萜环化酶作用下环化、重排生成次丹参酮二烯。基于次丹参酮二烯的诸多衍生物具有广阔的应用前景与需求，如鼠尾草酸，具有抗肿瘤等生物活性，可用于治疗神经退行性疾病，也可作为食品添加剂；中药单体雷公藤甲素具有免疫抑制、抗风湿等药理作用，同时也有不少研究报道了对乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的抑制作用。
2、由于此类物质在天然植物中含量极低，难以实现广泛应用；而通过在酿酒酵母等微生物宿主构建完整的合成途径，已经可以实现次丹参酮二烯的异源合成。中国专利cn111548946a公开了一种生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌，在高密度发酵过程中初始碳源为葡萄糖，发酵6h后换成半乳糖，180h达到最高浓度3.5g/l，这一浓度已初步达到工业生产要求，但半乳糖的使用与更替增加了生产成本和工艺操作，关键基因基于质粒的游离表达也限制了培养基对菌株的优化效果。如何构建更有生产前景与深入改造可行性的生产菌株，为次丹参酮二烯生产提供更多选择，对促进该药物的生物生产的实现具有重要意义。
技术实现思路
1、热带假丝酵母作为一种二倍体酵母，具有广泛的碳源，且已运用于二元酸、木糖醇的生产。本发明通过基因工程手段在热带假丝酵母中系统构建高效生产次丹参酮二烯的工程菌株，显著增加次丹参酮二烯的产量，提高其合成效率，促进其在医药和食品添加剂等领域中的应用。并且，本发明还提供了一种构建高效合成二萜类化合物酵母工程菌株的方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明提供了重组热带假丝酵母，所述重组热带假丝酵母在出发菌株的基因组上整合了次丹参酮二烯合成途径基因，包括：
4、(a)从乙酰辅酶a到甲羟戊酸合成相关基因：包括乙酰辅酶a硫解酶基因erg10、hmg-coa合成酶基因erg13和hmg-coa还原酶基因thmgr，并在酵母细胞质中表达；所述基因erg10的genbank登录号为：d13470.1，所述基因erg13的genbank登录号为：rck66100.1，所述基因thmgr的genbank登录号为：rck56388.1；
5、(b)从甲羟戊酸到ipp和dmapp合成相关基因：包括甲羟戊酸激酶基因erg12、磷酸甲羟戊酸激酶基因erg8、二磷酸甲羟戊酸激酶基因erg19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi1，并在细胞质或过氧化物酶体中过表达；所述基因erg12的genbank登录号为：rck63831.1，所述基因erg8的genbank登录号为：rck59297.1，所述基因erg19的genbank登录号为：rck60630.1，所述基因idi1的genebank登录号为：rck59267.1；
6、(c)从ipp和dmapp到次丹参酮二烯合成相关基因：包括香叶基/法尼基焦磷酸合酶基因erg20、ggpp合成酶基因bts1和丹参来源的ⅱ类二萜合酶基因smksl1、毛喉鞘蕊花来源的ⅰ类二萜合酶基因cftps1，并在酵母过氧化物酶体中过表达；所述基因erg20的genebank登录号为：rck67668.1，所述基因bts1的genbank登录号为：rck64891.1；所述基因smksl1的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因cftps1的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、在一种实施方式中，所述出发菌株包括但不限于热带假丝酵母atcc20336或热带假丝酵母cu-206；所述热带假丝酵母cu-206是以热带假丝酵母atcc20336进行改造制备得到的，其构建方法记载于论文“lihua zhang,et al.2020,acrispr–cas9 system formultiple genome editing and pathway assembly in candida tropicalis.biotechnolbioeng,117:531-542”中。
8、在一种实施方式中，所述过表达的基因通过同源重组整合到酵母染色体dna上稳定表达，所述基因在酵母染色体上整合的拷贝数为1～6。
9、本发明提供了一种合成次丹参酮二烯的基因表达盒，所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子-目的基因-转录终止子”结构单位；
10、其中，所述目的基因包括：
11、从乙酰辅酶a到甲羟戊酸合成的相关基因：erg10基因、erg13基因、thmgr基因；或将核苷酸序列如seq id no.1所示的epts分别连接至各基因的3’端的erg10-epts基因、erg13-epts基因、thmgr-epts基因；
12、从甲羟戊酸到ipp和dmapp合成的相关基因：erg12基因、erg8基因、erg19基因和idi1基因；或将核苷酸序列如seq id no.1所示的epts分别连接至各基因的3’端的erg12-epts基因、erg8-epts基因、erg19-epts基因和idi1-epts基因；
13、从ipp和dmapp到次丹参酮二烯合成的相关基因：cftps1基因、smksl1基因、erg20基因和bts1基因；或将核苷酸序列如seq id no.1所示的epts分别连接至各基因的3’端的cftps1-epts基因、smksl1-epts基因、erg20-epts基因和bts1-epts基因。
14、在一种实施方式中，所述表达盒包括：
15、(a)采用pgap1启动子和teno1终止子过表达erg10基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达thmgr基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg13基因的表达盒fao1-gda324-ura3-teno1-erg10-pgap1-t7syn-thmgr-pgap1-pfba1-erg13-tpgk1-fao1，命名为细胞质表达盒1c；
16、(b)将epts分别连接至erg10、erg13、thmgr基因的3’端后，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达erg10-epts基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达thmgr-epts基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg13-epts基因的表达盒fao1-gda324-ura3-teno1-epts-erg10-pgap1-t7syn-epts-thmgr-pgap1-pfba1-erg13-epts-tpgk1-fao1，命名为过氧化物酶体表达盒1p；
17、(c)采用pgap1启动子和teno1终止子过表达idi1基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达erg19基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg8基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg12基因的表达盒ald1-gda324-ura3-teno1-idi1-pgap1-pfba1-erg19-tadh2-t7syn-erg8-pgap1-pfba1-erg12-tpgk1-ald1，命名为细胞质表达盒2c；
18、(d)将epts分别连接至erg12、erg8、erg19、idi1基因的3’端后，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达idi1-epts基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达erg19-epts基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg8-epts基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg12-epts基因的表达盒ald1-gda324-ura3-teno1-epts-idi1-pgap1-pfba1-erg19-epts-tadh2-t7syn-epts-erg8-pgap1-pfba1-erg12-epts-tpgk1-ald1，命名为过氧化物酶体表达盒2p；
19、(e)采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg20基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达bts1基因，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达cftps1基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达smksl1基因的表达盒pox5-gda324-ura3-teno1--cftps1-pgap1-pfba1-bts1-tadh2-t7syn-erg20-pgap1-pfba1-smksl1-tpgk1-pox5，命名为细胞质表达盒3c；
20、(f)将epts分别连接至cftps1、smksl1、erg20、bts1基因的3’端后，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg20-epts基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达bts1-epts基因，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达cftps1-epts基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达smksl1-epts基因的表达盒pox5-gda324-ura3-teno1-epts1-cftps1-pgap1-pfba1-bts1-epts1-tadh2-t7syn-epts1-erg20-pgap1-pfba1-smksl1-epts1-tpgk1-pox5，命名为过氧化物酶体表达盒3p。
21、在一种实施方式中，所述基因erg10的genbank登录号为：d13470.1，所述基因erg13的genbank登录号为：rck66100.1，所述基因thmgr的genbank登rck56388.1；所述基因erg20的genbank登录号为：rck67668.1，所述基因bts1的genbank登录号为：rck64891.1；所述基因smksl1的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因cftps1的核苷酸序列如seq idno.3所示；
22、所述基因erg12的genbank登录号为：rck63831.1，所述基因erg8的genbank登录号为：rck59297.1，所述基因erg19的genbank登录号为：rck60630.1，所述基因idi1的genbank登录号为：rck59267.1。
23、在热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点中，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达ant1基因；所述基因ant1的genbank登录号为：rck55993.1；所述pgap1启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；pfba1启动子的核苷酸序列如seq id no.5所示。
24、本发明提供了一种重组热带假丝酵母，在基因组上整合所述细胞质表达盒1c或过氧化物酶表达盒1p，并整合所述细胞质表达盒2c或过氧化物酶表达盒2p，并整合所述细胞质表达盒3c或过氧化物酶表达盒3p整合。
25、在一种实施方式中，所述表达盒的整合位点包括但不限于fao1位点，ald1位点，pox5位点和dld1-1位点。
26、在一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母将表达cfpts1、smksl1、erg20和bts1的表达盒3c或含有核苷酸序列如seq id no.1所示的epts的表达cfpts1、smksl1、erg20和bts1的表达盒3p整合至热带假丝酵母基因组的pox5位点；
27、并将表达erg12、erg8、erg19和idi1的表达盒2c或含有核苷酸序列如seq id no.1所示的epts的表达erg12、erg8、erg19和idi1的表达盒2p整合至热带假丝酵母基因组的ald1位点；
28、并将表达erg10、erg13和thmgr的表达盒1c或含有核苷酸序列如seq id no.1所示的epts的表达erg10、erg13和thmgr的表达盒1p整合至热带假丝酵母基因组的fao1位点。
29、在一种实施方式中，将表达盒3p整合至热带假丝酵母基因组的pox5位点，并将表达盒2c整合至热带假丝酵母基因组的ald1位点，并将表达盒1c整合至热带假丝酵母基因组的fao1位点。
30、在一种实施方式中，将表达盒3p整合至热带假丝酵母基因组的pox5位点，并将表达盒2p整合至热带假丝酵母基因组的ald1位点，并将表达盒1c整合至热带假丝酵母基因组的fao1位点。
31、在一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母为：将所述表达盒2p整合至热带假丝酵母基因组的ald1位点；并将所述表达盒3p整合至热带假丝酵母基因组的pox5位点与dld1-1位点；并将表达盒1c整合至热带假丝酵母基因组的fao1位点。
32、在一种实施方式中，次丹参酮二烯合成途径中erg10、erg13和thmgr在酵母细胞质中表达；erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、bts1、smksl1和cftps1在酵母过氧化物酶体中过表达。
33、在一种实施方式中，所述基因erg10、erg13和thmgr整合在fao1位点表达，所述基因erg12、erg8、erg19和idi1整合在ald1位点表达，所述基因erg20、bts1、cftps1和smksl1整合至pox5位点表达。
34、在一种实施方式中，在dld1-1位点过表达erg20、bts1、cftps1和smksl1，在dld1-2位点过表达erg10和nadh-hmgr，在原ura3位点过表达ant1进一步强化菌株的次丹参酮二烯生产能力。
35、本发明提供了一种提高热带假丝酵母合成次丹参酮二烯的产量的方法，所述方法包括以下步骤：
36、(1)在热带假丝酵母的细胞质中过表达从乙酰辅酶a到甲羟戊酸合成的相关基因，得到工程菌1；
37、(2)在工程菌1的过氧化物酶体中过表达从甲羟戊酸到ipp和dmapp合成的相关基因，得到工程菌2；
38、(3)在工程菌2的过氧化物酶体中过表达从ipp和dmapp到次丹参酮二烯合成的相关基因。
39、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
40、(1)在热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点中，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达erg10基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达thmgr基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg13基因，得到工程菌1；
41、(2)在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，将核苷酸序列如seq idno.1所示的epts分别连接至erg12、erg8、erg19、idi1基因的3’端后，在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，采用pgap1启动子和teno1终止子过表达idi1-epts基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达erg19-epts基因，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg8-epts基因，及采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达erg12-epts基因，得到工程菌2；
42、(3)在工程菌2基因组上不影响其生长的任一位点中，将核苷酸序列如seq idno.1所示的将epts分别连接至cftps1、smksl1、erg20、bts1基因的3’端后，在工程菌2基因组上不影响其生长的任一位点中，采用pgap1启动子和t7syn终止子过表达erg20-epts基因，采用pfba1启动子和tadh2终止子过表达bts1-epts基因，及采用pgap1启动子和teno1终止子过表达cftps1-epts基因，采用pfba1启动子和tpgk1终止子过表达smksl1-epts基因。
43、在一种实施方式中，以热带假丝酵母为宿主，所述热带假丝酵母包括但不限于热带假丝酵母atcc20336或热带假丝酵母cu-206。
44、在一种实施方式中，整合至热带假丝酵母基因组上的位点包括但不限于fao1位点，ald1位点，pox5位点，dld1-1位点。
45、本发明还提供了一种合成次丹参酮二烯的方法，所述方法以葡萄糖为碳源，采用上述任一所述的重组热带假丝酵母发酵。
46、在一种实施方式中，所述发酵培养基为ypd60培养基。
47、在一种实施方式中，所述方法是将酵母工程菌株在ypd中培养种子，当od600到达12～16后，制备得到种子液，将制备得到的种子液按照5％～12％(v/v)的比例转接到发酵培养基，然后在25～40℃发酵至少48h。
48、在一种实施方式中，将重组热带假丝酵母在种子培养基中进行培养，当od600到达12～16后，制备得到种子液，将制备得到的种子液按照5％～12％(v/v)的比例转接到发酵培养基，在30℃进行补料发酵，发酵时间至少72h。
49、本发明还提供了上述基因表达盒，或上述重组热带假丝酵母，或上述方法在制备次丹参酮二烯或含有次丹参酮二烯的产品中的应用。
50、在一种实施方式中，所述产品为食品、药品或化工原料。
51、有益效果
52、(1)本发明从工业生产菌株出发，利用合成生物学技术和代谢工程手段构建了高效合成次丹参酮二烯的酵母工程菌株，以葡萄糖为主要碳源，最终在264h时次丹参酮二烯的产量达到最高4170.33mg·l-1。
53、(2)本发明首次发现并证明将次丹参酮二烯合成途径中erg10、erg13和thmgr(对应代谢途径中从乙酰辅酶a到甲羟戊酸合成基因)在酵母细胞质中表达，erg20、bts1和cftps1、smksl1(对应代谢途径中从ipp和dmapp到次丹参酮二烯合成基因)在酵母过氧化物酶体中过表达，而erg12、erg8、erg19和idi1(对应代谢途径中从甲羟戊酸到ipp和dmapp合成基因)在过氧化物酶体中过表达是最有效的次丹参酮二烯合成菌株构建方式。
1.重组热带假丝酵母，其特征在于，在出发菌株的基因组上过表达次丹参酮二烯合成途径基因，包括：
2.根据权利要求1所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，将含有所述基因的基因表达盒在出发菌株的基因组上整合表达；所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子-目的基因-转录终止子”结构单位；所述目的基因包括：
3.根据权利要求2所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，所述表达盒的整合位点包括但不限于fao1位点，ald1位点，pox5位点和dld1-1位点。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，所述过表达是将基因通过同源重组整合到酵母染色体dna上稳定表达，所述基因在酵母染色体上整合的拷贝数为1～6。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，所述出发菌株包括但不限于热带假丝酵母atcc20336或热带假丝酵母cu-206。
6.一种提高热带假丝酵母合成次丹参酮二烯的产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.一种制备次丹参酮二烯的方法，其特征在于，应用权利要求1～5任一所述的重组热带假丝酵母，以葡萄糖为碳源进行发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基为ypd60培养基；可选地，发酵过程还补料葡萄糖。
10.权利要求1～5任一所述的重组热带假丝酵母，或权利要求7～9任一所述方法在制备次丹参酮二烯或含有次丹参酮二烯的产品中的应用。
