本发明属于生物医用材料，尤其涉及一种交联重组胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
1、胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱、韧带和血管等结缔组织中。作为一种结构蛋白，胶原蛋白在维持组织的结构完整性和功能中起着关键作用。胶原蛋白的独特三螺旋结构赋予其优异的机械性能和生物相容性，使其成为医美和生物医学领域中备受关注的生物材料。然而，天然胶原蛋白的获取受到来源的限制，且存在潜在的病原体传播风险。因此，通过基因重组技术制备重组胶原蛋白不仅能保证其安全性，还能实现大规模生产，以满足日益增长的市场需求。此外，重组胶原蛋白的纯度高、批次间一致性好，能够根据需要进行序列优化和修饰，从而进一步提升其功能性能。这些优势使得重组胶原蛋白在生物材料领域具有广阔的应用前景。
2、在医美领域，皮肤填充剂是最常用的产品之一。现有的皮肤填充剂如肉毒杆菌毒素和透明质酸虽然在医美领域得到了广泛应用，但也存在一些显著的局限性。肉毒杆菌毒素主要通过阻断神经信号来放松肌肉，虽然能够有效减少皱纹，但其作用时间相对较短，需要频繁注射，且可能导致局部肌肉麻痹等副作用。透明质酸作为皮肤填充剂，具有良好的填充效果和保湿能力，但其在体内的降解速度较快，需要频繁补充。此外，未交联的胶原蛋白虽然具有良好的生物相容性，但其力学性能较差，难以长时间维持填充效果。因此，开发新型交联重组胶原蛋白材料显得尤为重要。
3、交联技术的应用，特别是利用γ-pga(γ-聚谷氨酸，一种由谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成的生物高分子)与胶原蛋白的交联，显著提升了材料的力学性能、稳定性和耐久性，为临床应用提供了更为理想的解决方案。其中，edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)交联技术具有较大的优势。edc是一种水溶性碳二亚胺，能够在温和的反应条件下将羧基和胺基交联，形成稳定的酰胺键。而nhs能够提高edc的交联效率，减少副反应的发生。edc和nhs的联合使用，不仅能够显著提高交联效率，还能减少交联反应中的副产物和残留物，进一步提升材料的生物相容性和安全性。基于上述交联技术的优势，本发明提出一种交联重组胶原蛋白及其制备方法和应用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种交联重组胶原蛋白及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明采用基因重组技术成功制备了重组人源iii型胶原蛋白。通过重组技术制备的胶原蛋白，不仅可以保证其安全性和一致性，还能实现大规模生产，以满足市场需求。在研究中发现，重组人源iii型胶原蛋白具有与天然胶原蛋白相似的三螺旋结构。这种结构不仅赋予了胶原蛋白优异的力学性能和生物相容性，还使其能够进一步组装成更大分子量的胶原纤维。这些胶原纤维在组织工程和再生医学中具有重要的应用价值。然而，重组胶原蛋白在水溶性和力学性能上仍存在一些不足，特别是在体内应用时，未交联的胶原蛋白难以保持持久的功能，影响其临床应用效果。为了解决这一问题，本发明进一步对重组胶原蛋白进行交联处理。通过γ-pga以及edc和nhs的反应，制备出一种交联重组胶原蛋白材料。本发明提供如下技术方案：
3、一种交联重组胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤1、通过生物信息学方法设计并优化得到重组人源iii型胶原蛋白(胶原蛋白由来自天然人iii型胶原蛋白的氨基酸序列构成，gxy区段可形成三螺旋结构，该胶原蛋白经nhs和edc活化后，以共价键形式进行分子间偶联)的氨基酸序列如seq id no:1所示，将通过密码子偏好性优化后的重组人源iii型胶原蛋白基因插入表达载体，使用ecori和hindiii双酶切连接，完成重组载体的构建；
5、步骤2、选择合适的真核表达系统，将构建好的表达载体转染至选定的真核宿主细胞中；利用选择标记筛选阳性克隆；从阳性克隆中挑选高表达候选株进行摇瓶培养，细胞密度达到要求后转移至3l发酵罐，在3l发酵罐中通过补加培养基保持细胞密度，细胞密度达到目标后降温进行蛋白表达，并检测发酵上清液中的蛋白质表达量；
6、步骤3、收集发酵上清液，离心去除细胞碎片，对表达的蛋白进行纯化；使用适当方法对纯化后的蛋白进行验证；
7、步骤4、将纯化后的蛋白透析到注射用水中，使用超滤管浓缩胶原蛋白溶液，进行冻干处理，包括预冻、升华干燥和解析干燥；
8、步骤5、将冻干后的胶原蛋白溶解在20mm磷酸盐缓冲液或0.1m mes缓冲液中，制备终浓度为1-100mg/ml的胶原蛋白溶液，优选5-50mg/ml，更优选35mg/ml。将γ-pga溶解在0.1m mes缓冲液中，加入nhs和edc，将溶液在室温下孵育1小时，活化γ-pga的羧基；将活化后的γ-pga溶液等量加入到胶原蛋白溶液中，混合均匀；在4-35℃下进行交联反应，在约4℃或约25℃进行，反应时间为1-24小时，优选约4小时，即得交联重组胶原蛋白；通过100倍体积的20mm磷酸盐缓冲液透析，每24小时换液一次，重复3次，过程在4℃下进行；将交联反应后的产物进行冷冻干燥处理，得到海绵状物；将海绵状物粉碎成颗粒，并置于100-1000倍体积的生理盐水或注射用水中进行清洗，清洗过程中多次换液，清洗过程在4-25℃下进行；将清洗后的颗粒溶胀于生理盐水中，使交联重组胶原蛋白的含量达到35mg/ml。
9、进一步的，所述重组人源iii型胶原蛋白可以带有使其易于纯化的标签，标签为his标签、flag标签或c-myc标签。如果能满足后续的要求可以不带。重组人源iii型胶原蛋白经过纯化后，通过nr-sds-page验证其分子量。
10、进一步的，所述重组人源iii型胶原蛋白不仅具有三螺旋结构，还可以进一步组装成较大的胶原纤维。
11、进一步的，所述真核表达系统采用cho细胞或酵母表达系统。
12、进一步的，所述冻干处理的过程具体如下：
13、预冻：在-40℃下进行预冻处理，时间为8小时；
14、升华干燥：在-15℃下进行升华干燥，压力为20pa，时间为20小时；
15、解析干燥：在-5℃下进行解析干燥，压力为20pa，时间为8小时。
16、进一步的，所述mes缓冲液的ph为3.6。
17、进一步的，所述γ-pga的分子量为70-1000kda，γ-pga的浓度为10-800mg/ml，优选30-400mg/ml。
18、进一步的，所述nhs与edc的比例为1:5-1:1，edc与γ-pga的羧基比例为1:8-1:1。
19、一种根据上述所述的制备方法制得的交联重组胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物降解性，且交联重组胶原蛋白在体内具有良好的生物稳定性，不易被降解，能够长期维持其结构和功能。适用于多种生物医学应用，如皮肤填充剂、组织工程支架和伤口敷料等领域，能够提供长效、自然的填充效果，并在应用中表现出良好的安全性和有效性。
20、进一步的，所述交联重组胶原蛋白在2-8℃下具有至少36个月的稳定存在期(在至少约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月、约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的)。
21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22、本发明结合了重组技术与交联技术，成功制备出了一种新型生物材料。该材料以重组胶原蛋白为核心基础，通过与γ-pga进行交联，形成具有一定力学属性的交联物，利用edc和nhs作为交联剂，所得交联产品具有优异的力学性能和生物相容性，并且交联效果显著，残留物少。重组胶原蛋白与γ-pga交联后的材料表现出良好的弹性和机械强度，适用于多种生物医学应用，具有潜在的市场应用价值，特别是在医美和生物工程领域。
1.一种交联重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达系统采用cho细胞或酵母表达系统。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干处理的过程具体如下：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述mes缓冲液的ph为3.6。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述γ-pga的分子量为70-1000kda，γ-pga的浓度为10-800mg/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述nhs与edc的比例为1:5-1:1，edc与γ-pga的羧基比例为1:8-1:1。
7.一种根据权利要求1-6任一所述的制备方法制得的交联重组胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的交联重组胶原蛋白，其特征在于，所述交联重组胶原蛋白在2-8℃下具有至少36个月的稳定存在期。
9.一种根据权利要求7或8所述的交联重组胶原蛋白在制备皮肤填充剂、组织工程支架和伤口敷料中的应用。
