本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫安全性和免疫原性中的应用。
背景技术：
1、新城疫是由新城疫病毒（ndv）引起的一种高度接触性、急性、烈性传染病，可感染多种家禽，对我国家禽产业形成巨大威胁。疫苗接种是防控新城疫的有效措施之一。在规模化养殖场，疫苗的群体化投放是提高疫苗接种工作效率、节约人力成本和降本增效的重要途径。
2、在鸡胚胎发育后期（约18胚龄），鸡胚的免疫系统基本发育完全，具备正常的免疫应答能力。通过胚内接种疫苗的方式可以激活胚胎的早期免疫系统，而为雏鸡提供早期免疫保护，缩短免疫空白期。胚内免疫技术早在20世纪80年代被提出，20世纪90年代逐步商业化。目前世界上包括美国在内的多个国家采用此项技术对马立克氏病、传染性法氏囊病进行早期的孵化场免疫。与传统的免疫技术相比，胚内免疫有如下优势：1）可以更早地诱导雏鸡产生特异性免疫，填补免疫空白期；2）免疫效果均一确实；3）联苗胚内接种可减少雏鸡的免疫频率，避免免疫过程中的应激反应和死亡；4）自动化平台免疫接种可显著提高接种速度，极大减少人力资源的消耗。随着我国禽业集约化养殖水平的提高，胚内免疫发展前景广阔，有望在禽病预防和控制中发挥重要作用。
3、然而，目前市场上尚没有基于ndv的适用于胚内免疫的新城疫疫苗。la sota株是目前使用最为广泛的活疫苗，主要通过滴鼻点眼、饮水、喷雾等方式接种。但是la sota对鸡胚的毒力较强，接种18日龄鸡胚造成孵化率显著下降、孵化雏鸡的死亡率较高。因此，lasota不能直接用于胚内免疫接种。此外，lasota疫苗在1日龄新生雏鸡中诱导的抗体应答较弱，难以提供满意的早期免疫保护。国际动保公司推出了以火鸡疱疹病毒（hvt）为载体表达ndv融合蛋白的病毒载体疫苗，该疫苗可通过胚内免疫途径接种。但是，需要指出的是，由于hvt之间存在严重的干扰，同一个养殖场不能同时应用两种以上的hvt疫苗；且hvt需要液氮保存。因此，迫切需要研制新型的新城疫胚胎疫苗。因此，提高ndv弱毒活疫苗对胚胎的安全性与免疫原性，是研制新型新城疫胚胎疫苗以及推进胚内免疫技术临床应用首先要突破的瓶颈。
技术实现思路
1、为克服ndv弱毒活疫苗对胚内免疫的毒性和免疫效果较差的问题，本发明提供了ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫安全性和免疫原性中的应用，本发明选用临床上广泛使用的ndv弱毒株la sota，首先评价了病毒对18日龄鸡胚与孵化雏鸡的毒力；接着筛选了病毒感染后发生显著变化的宿主细胞死亡相关基因；进一步选择细胞坏死性凋亡关键蛋白ripk3为靶标，评价了ripk3抑制剂gsk840对lasota对于鸡胚与雏鸡毒力与免疫原性的影响。本发明发现细胞坏死性凋亡关键蛋白ripk3对ndv弱毒疫苗的胚胎毒性具有重要影响，抑制ripk3的活性可显著提高病毒接种鸡胚的孵化率与存活率，并显著增强雏鸡的hi抗体水平。本发明提供了ripk3蛋白在提升ndv弱毒活疫苗胚胎安全性与免疫原性方面的新的应用，在研制安全、高效的新城疫胚胎疫苗方面具有较好的应用前景。
2、本发明的目的通过以下技术方案来实现：
3、ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫安全性中与免疫原性的应用，所述ripk3蛋白的序列为genbank no. xp_040536973.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。
4、进一步的，所述应用包括：通过抑制ripk3蛋白的活性提高雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后的孵化率与存活率。
5、进一步的，所述新城疫活疫苗为la sota株。
6、进一步的，所述ripk3基因表达水平的检测引物序列如seq id no.27~28所示。
7、进一步的，采用ripk3蛋白抑制剂抑制ripk3蛋白的活性。
8、进一步的，所述ripk3蛋白抑制剂为gsk840。
9、进一步的，所述ripk3蛋白抑制剂用于抑制雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后坏死性凋亡执行蛋白mlkl的激活。
10、进一步的，所述ripk3蛋白抑制剂的剂量为0.2~0.5 mg/胚。
11、进一步的，所述新城疫病毒的病毒载量检测引物序列如seq id no.33~34所示。
12、本发明还提供了ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫原性中的应用，所述ripk3蛋白的序列为genbank no. xp_040536973.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。
13、进一步的，所述应用包括：通过抑制ripk3蛋白的活性提高雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后的hi抗体水平。
14、首先，用ndv弱毒活疫苗la sota经胚内接种18日龄鸡胚，剂量为104eid50，测定病毒感染后鸡胚孵化率和雏鸡生存率。
15、进一步的，采集未出壳死亡雏鸡和已孵出雏鸡的肺脏、肝脏、十二指肠，利用相对荧光定量pcr方法检测组织中细胞死亡和固有免相关基因的表达水平，引物见seq idno.1-32。
16、进一步的，建立绝对荧光定量pcr方法测定雏鸡肺脏、肝脏、十二指肠中的病毒复制水平。以la sota np（genbank: or826377.1）基因为模板，设计绝对荧光定量的上下游引物及探针，见seq id no.33-35，探针5’端为fam荧光基团，3’端为mgb荧光基团。以la sota第1-2383 nt基因为模板，设计一对引物，序列如seq id no.36和seq id no.37所示，扩增la sota第1-2383 nt基因片段，扩增的片段序列见seq id no.38；将基因片段克隆入pce2ta/blunt-zero载体，构建成功的质粒作为绝对荧光定量pcr的标准质粒。
17、进一步的，利用绝对荧光定量pcr，检测肺脏、肝脏、十二指肠中的la sota病毒拷贝数。计算标准品拷贝数，取标准品10倍倍比稀释，绘制标准曲线，在qpcr管中配置如下体系：2 × aceq qpcr probe master mix 10 ul、primer 1 (10 µm) 0.4 ul、primer 2 (10µm) 0.4 ul、taqman probe (10 µm) 0.2 ul、cdna 1 ul、ddh2o 7 ul。反应程序为：预变性reps: 1，95℃ 5 min、循环反应reps:40，95℃ 10 sec 60℃ 30 sec。将ct值代入标准曲线计算拷贝数。
18、进一步的，基于对病毒感染鸡胚中宿主应答的分析，选择变化幅度较大的细胞坏死性凋亡作为研究靶点。首先通过药物处理抑制ripk3活性而阻断坏死性凋亡应答。将ripk3抑制剂gsk840通过胚内注射途径接种18日龄鸡胚，药物剂量为0.2、0.5、1.0 mg/胚，记录鸡胚孵化率、雏鸡生存率与体重变化。
19、进一步的，将gsk840与la sota同时接种18日龄鸡胚，药物剂量为0.2与0.5 mg/胚，记录鸡胚孵化率、雏鸡死亡率、体重变化与临床表现。
20、进一步的，在雏鸡孵化后14天内，采集各组死亡雏鸡的肺脏；14天后，采集各组存活鸡的肺脏。
21、进一步的，利用western blot方法检测ripk3、mlkl蛋白的表达水平；用绝对荧光定量pcr测定肺脏中病毒载量。
22、进一步的，采集病毒接种14天后的存活鸡血清，测定hi抗体滴度。
23、有益效果
24、病毒的毒力与其诱导产生的宿主细胞死亡应答密切相关。坏死性凋亡是病毒感染诱导的重要细胞死亡类型之一。发生坏死性凋亡的细胞会破裂，释放胞内物质，刺激炎性反应，增强病毒的致病性。坏死性凋亡的信号转导过程包括：受体互作蛋白激酶1（ripk1）与ripk3互作，ripk3的激酶活性使其下游的混合谱系激酶结构域样（mlkl）蛋白磷酸化而激活，活化的mlkl发生寡聚化，形成细胞膜穿孔复合物导致细胞裂解。以ripk3为靶点抑制病毒感染诱导的坏死性凋亡可以显著减轻流感等疾病的致病性，是研制抗病毒药物的新靶标。因此，通过调控坏死性凋亡是调控病毒毒力的可行途径。
25、本发明提供了ndv弱毒活疫苗la sota致死鸡胚的潜在机制，即病毒感染激活的宿主细胞死亡应答可能导致了鸡胚的死亡与孵化雏鸡的发病死亡，克服了新城疫活疫苗lasota株仅能通过滴鼻点眼、饮水、喷雾等方式接种，不能直接用于胚内接种的技术问题，为进一步提升ndv活疫苗的安全性提供了新的思路。
26、本发明提供了ripk3蛋白在提升ndv胚胎疫苗安全性与免疫原性中的新应用，为解决现有ndv活疫苗的胚胎毒性与免疫效力问题提供了新的靶点。
1. ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫安全性中的应用，其特征在于，所述ripk3蛋白的序列为genbank no. xp_040536973.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：通过抑制ripk3蛋白的活性提高雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后的孵化率与存活率。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新城疫活疫苗为la sota株。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ripk3基因表达水平的检测引物序列如seq id no.27~28所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用ripk3蛋白抑制剂抑制ripk3蛋白的活性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ripk3蛋白抑制剂为gsk840。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ripk3蛋白抑制剂用于提高雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后的hi抗体水平。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ripk3蛋白抑制剂用于抑制雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后坏死性凋亡执行蛋白mlkl的激活。
9. ripk3蛋白在提高新城疫活疫苗胚胎免疫原性中的应用，其特征在于，所述ripk3蛋白的序列为genbank no. xp_040536973.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：通过抑制ripk3蛋白的活性提高雏鸡在新城疫活疫苗胚胎免疫后的hi抗体水平。
