本发明涉及中药，具体地涉及一种干蟾皮提取物的质量检测方法及指纹图谱构建方法。
背景技术：
1、干蟾皮作为一种重要的中药材，目前的研究主要聚焦于蟾蜍内烯二酯类，认为其为干蟾中抗肿瘤作用的主要活性成分，然而无论在传统应用(水煎剂或研末入丸散服用)，还是现代临床制剂制备如华蟾素注射液、华蟾素口服液、华蟾素片等，均以水提取为主要工艺，所以含有大量的亲水性成分。在临床中，这些华蟾素类制剂用于肝癌、肝炎、肠癌、肠炎、肺癌等各种疾病的治疗，并起到较好的临床治疗效果。目前药效研究也发现，吲哚烷基胺类成分蟾蜍噻咛具有一定抑制炎症、改善肿瘤微环境，以及协同促进蟾蜍二烯内酯类成分蟾毒灵的抗肿瘤作用。因此，不管是水溶性的吲哚烷基胺类成分还是脂溶性的蟾蜍二烯内酯类都有其特有的，甚至相互协同的治疗作用。
2、众所周知，干蟾皮作为动物类药材，其质量不稳定，有效成分提取困难，且成本较高。目前对干蟾皮及蟾酥化学成分研究主要集中于某一类成分，如蟾蜍二烯内酯类(脂溶性成分)或吲哚烷基胺(水溶性成分)，而未见同时提取和检测这两类成分的报道。
3、因此，考虑到中医治疗特色，以中药多成分、多靶点在临床综合运用为治疗优势，以及蟾蜍作为中药保护品种，本领域亟需建立干蟾皮中水溶性成分和脂溶性成分的一次性提取方法及检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种能够同时鉴定干蟾皮提取物中的蟾蜍二烯内酯类(脂溶性成分)或吲哚烷基胺(水溶性成分)物质的质量检测方法及指纹图谱构建方法。
2、本发明的第一方面提供了一种同时测定干蟾皮提取物中的吲哚烷基胺和蟾蜍二烯内酯类成分的质量检测方法，包括下述步骤：
3、(1)制备供试品溶液；其中，所述供试品溶液为含有干蟾皮提取物的溶液；
4、(2)采用高效液相色谱测定步骤(1)中的供试品溶液，得到所述供试品溶液的液相色谱；
5、其中，高效液相色谱的流动相a为0.05％-0.5％(v/v)乙酸水溶液，流动相b为乙腈；
6、采用梯度洗脱方式洗脱，所述梯度洗脱的条件如下所述：
7、
8、上述百分比分别为流动相a或流动相b与流动相a和流动相b之和的体积之比。
9、在另一优选例中，所述方法还包括配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的配制方法包括以下步骤：将蟾蜍特尼定、脱氢蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的对照品分别用甲醇溶解并混合，得到混合对照品溶液；
10、采用与所述供试品溶液相同的高效液相色谱条件对所述混合对照品溶液进行测试，得到混合对照品溶液的色谱图；将所述混合对照品溶液的色谱图与所述供试品溶液的液相色谱进行对比，用于指认干蟾皮提取物指纹图谱中的色谱峰。
11、在另一优选例中，所述方法用于同时鉴定包含3种吲哚烷基胺类化合物和8种蟾蜍内烯二酯类化合物的11种化合物。
12、在另一优选例中，使用所述方法可以分离获得来自干蟾皮提取物的至少14种成分对应的色谱峰。
13、在另一优选例中，流动相a为0.3％(v/v)乙酸水溶液；流动相b为乙腈。
14、在另一优选例中，所述高效液相色谱的流速为0.1-0.3ml/min。
15、在另一优选例中，所述高效液相色谱的流速为0.1ml/min。
16、在另一优选例中，所述高效液相色谱的柱温为25～35℃。
17、在另一优选例中，所述高效液相色谱的柱温为30℃。
18、在另一优选例中，所述高效液相色谱的色谱柱为c18色谱柱。
19、在另一优选例中，所述高效液相色谱的色谱柱为agilent extend-c18(4.6×150mm,5μm)色谱柱。
20、在另一优选例中，所述高效液相色谱的检测波长为254-296nm，更佳地280-296nm。
21、在另一优选例中，所述供试品溶液为干蟾皮药材在溶剂中超声提取后得到的上清液；所述溶剂选自有机溶剂、水，或其组合。
22、在另一优选例中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇。
23、在另一优选例中，所述溶剂为乙醇的水溶液。
24、在另一优选例中，所述溶剂为25％-75％(v/v)乙醇的水溶液。
25、在另一优选例中，所述超声提取的时间为40-80min。
26、在另一优选例中，所述超声的功率为200-500w；频率为30-50khz。
27、在另一优选例中，所述溶剂与干蟾皮药材的重量比为10:1-20:1。
28、在另一优选例中，所述梯度洗脱的条件如下所述：
29、
30、上述百分比分别为流动相a或流动相b与流动相a和流动相b之和的体积之比。
31、本发明的第二方面提供了一种干蟾皮提取物的指纹图谱构建方法，其包括下述步骤：
32、利用高效液相色谱检测供试品溶液，将检测结果生成指纹图谱即可；
33、其中，所述供试品溶液为含有干蟾皮提取物的溶液；
34、所述高效液相色谱的流动相a为0.05％-0.5％(v/v)乙酸水溶液，流动相b为乙腈；
35、采用梯度洗脱方式洗脱，所述梯度洗脱的条件如下所述：
36、
37、
38、上述百分比分别为流动相a或流动相b与流动相a和流动相b之和的体积之比。
39、在另一优选例中，生成所述指纹图谱的方法包括通过将色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中得到。
40、在另一优选例中，所述指纹图谱包括至少3种吲哚烷基胺类化合物和至少8种蟾蜍内烯二酯类化合物对应的色谱峰。
41、在另一优选例中，所述吲哚烷基胺类化合物选自：蟾蜍特尼定、脱氢蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛；所述蟾蜍内烯二酯类化合物选自：日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基。
42、在另一优选例中，所述高效液相色谱的检测波长为254-296nm，更佳地280-296nm。
43、在另一优选例中，所述供试品溶液为干蟾皮药材在溶剂中超声提取后得到的上清液；所述溶剂选自有机溶剂、水，或其组合。
44、在另一优选例中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇。
45、在另一优选例中，所述溶剂为乙醇的水溶液。
46、在另一优选例中，所述溶剂为25％-75％(v/v)乙醇的水溶液。
47、在另一优选例中，所述超声提取的时间为40-80min。
48、在另一优选例中，所述超声的功率为200-500w；频率为30-50khz。
49、在另一优选例中，所述溶剂与干蟾皮药材的重量比为10:1-20:1。
50、在另一优选例中，所述梯度洗脱的条件如下所述：
51、
52、上述百分比分别为流动相a或流动相b与流动相a和流动相b之和的体积之比。
53、在另一优选例中，所述干蟾皮提取物指纹图谱包括14个共有峰，具体如下：
54、1号峰，相对保留时间为0.725；
55、2号峰，为蟾蜍特尼定，相对保留时间为0.786；
56、3号峰，为脱氢蟾蜍色胺，相对保留时间为0.878；
57、4号峰，为蟾蜍噻咛，相对保留时间为1；
58、5号峰，为日蟾毒它灵，相对保留时间为1.910；
59、6号峰，为沙蟾毒精，相对保留时间为2.283；
60、7号峰，相对保留时间为2.9678；
61、8号峰，为远华蟾毒精，相对保留时间为3.056；
62、9号峰，相对保留时间为3.135；
63、10号峰，为蟾毒它灵，相对保留时间为3.209；
64、11号峰，为华蟾毒它灵，相对保留时间为3.346；
65、12号峰，为蟾毒灵，相对保留时间为3.545；
66、13号峰，为华蟾酥毒基，相对保留时间为3.863；
67、14号峰，为酯蟾毒配基，相对保留时间为3.942。
68、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种同时测定干蟾皮提取物中的吲哚烷基胺和蟾蜍二烯内酯类成分的质量检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的配制方法包括以下步骤：将蟾蜍特尼定、脱氢蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的对照品分别用甲醇溶解并混合，得到混合对照品溶液；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于同时鉴定包含3种吲哚烷基胺类化合物和8种蟾蜍内烯二酯类化合物的11种化合物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流速为0.1-0.3ml/min。
5.一种干蟾皮提取物的指纹图谱构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱包括至少3种吲哚烷基胺类化合物和至少8种蟾蜍内烯二酯类化合物对应的色谱峰。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液为干蟾皮药材在溶剂中超声提取后得到的上清液；所述溶剂选自有机溶剂、水，或其组合。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超声提取的时间为40-80min。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶剂与干蟾皮药材的重量比为10:1-20:1。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述干蟾皮提取物指纹图谱包括14个共有峰，具体如下：
