本发明属于毒性评价，涉及一种评价中药配伍毒性变化趋势的模型及其构建方法和应用。
背景技术：
1、中药方剂的配伍是中药临床应用的基础框架，合理的中药配伍可以达到减毒增效的目的。现有技术中，配伍中药的毒性评判，主要通过细胞实验、啮齿类动物体内外实验来验证毒性的大小及变化规律，但此方法耗时较长，效率较低，不经济且操作繁琐等。
2、果蝇是双翅目果蝇科果蝇属的一种，具有生活史短、易饲养、繁殖快、染色体少、突变型多、个体小等特点，是生物学研究中最重要的模式生物之一。果蝇作为研究人类疾病的模式生物，与哺乳动物不仅在基本的生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似，而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。
3、吴茱萸常用于治疗肝寒气滞诸痛、脾胃阳虚和五更泄泻，现代药理研究表明吴茱萸具有抗炎、抗肿瘤和心脏保护等作用，但研究表明，吴茱萸具有潜在的肝毒性。补骨脂是中医常用的一味温肾助阳的良药，具抗癌、抗炎、抗骨质疏松、降血糖、免疫调节、抑菌和保护心血管的作用，但临床上使用补骨脂及其制剂的患者会出现肝、肾和生殖毒性等副作用。因此，如何准确、快速、高效地评价中药配伍的毒性是中药毒性研究面临的重要问题。
技术实现思路
1、本发明为解决现有技术中缺乏准确、快速、高效地评价吴茱萸和补骨脂及其配伍毒性变化趋势的方法，提供一种基于果蝇模式生物评价中药配伍毒性变化趋势的模型及其构建方法和应用。
2、本发明的目的之一在于提供一种基于果蝇模式生物评价中药配伍毒性变化趋势模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
3、s1：将雌、雄果蝇分别饲养于含有不同中药培养基和对照培养基的容器中，检测上述含有不同培养基的容器中果蝇的死亡数，使用微生信工具绘制kaplan-meier生存曲线；
4、s2：收集s1中所述容器中培养的雌、雄果蝇，分别加入提取缓冲液并在浴中匀浆，离心，收集获得上清液，使用试剂盒对获得的上清液进行酶活性的检测；
5、s3：收集s1中所述容器中培养的雌、雄果蝇，先进行rna提取，再合成cdna，以上述获得的cdna为模板，对待测基因进行定量实时pcr检测，获得基因表达水平结果；
6、s4：根据s1中获得的生存曲线、s2中获得的酶活性检测结果和s3中获得的定量实时pcr检测结果综合评价中药配伍毒性的变化趋势。
7、在本发明的一个优选实施例中，s1中所述果蝇死亡数的检测方法为：将果蝇分别放入含有不同中药培养基的容器中，在24℃培养光照12h昼夜交替，每天统计果蝇的死亡数。
8、在本发明的一个优选实施例中，s1中所述对照培养基的组成包括：52.5g玉米粉、27.5g蔗糖、20g酵母、8g琼脂、0.25ml丙酸和500ml超纯水；s1中所述中药培养基是在对照培养基的基础上分别添加吴茱萸、左金丸、吴茱萸汤、补骨脂、二神丸或四神丸中任意一项的中药提取物冻干粉；所述含有吴茱萸、左金丸或吴茱萸汤任意一项中药提取物的培养基中吴茱萸浓度为0.01g/ml；所述含有补骨脂、二神丸和四神丸任意一项中药提取物的培养基中补骨脂浓度为0.02g/ml；所述中药提取物冻干粉添加量为：吴茱萸的添加量为1.46g；所述左金丸的添加量为6.579g；所述吴茱萸汤的添加量为8.83g；所述补骨脂的添加量为3.39g；所述二神丸的添加量为8.72g；所述四神丸的添加量为14.95g。
9、在本发明的一个优选实施例中，所述左金丸是由吴茱萸和黄连按照6：1的质量比混合组成；所述吴茱萸汤是由吴茱萸、生姜、人参和大枣按照3：6：3：4的质量比混合组成；所述二神丸是由盐补骨脂、煨肉豆蔻、大枣和生姜按照2：1：1：1的质量比混合组成；所述四神丸是由盐补骨脂、煨肉豆蔻、醋制五味子、制吴茱萸、大枣和生姜按照4：2：2：1：2：2的质量比混合组成。
10、在本发明的一个优选实施例中，s2中所述离心条件为：在4℃、8000g条件下离心10min，所述酶活性检测对象为乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽s-转移酶。
11、在本发明的一个优选实施例中，s3中所述待测基因包括：gstd7、phgpx、hsp83、cpr、cyp6a8、sirt1、keap1、hsp22、hsp68和gstd6基因；所述gstd7基因id为48340，所述phgpx基因id为38413；所述hsp83基因id为38389；所述cpr基因id为33883；所述cyp6a8基因id为36666；所述sirt1基因id为34708；所述keap1基因id为42062；所述hsp22基因id为6737407；所述hsp68基因id为42852；所述gstd6基因id为48339。
12、在本发明的一个优选实施例中，所述gstd7基因的引物组中上游引物序列为seqid no.1所示，下游引物序列为seq id no.2所示；所述phgpx基因的引物组中上游引物序列为seq id no.3所示，下游引物序列为seq id no.4所示；所述hsp83基因的引物组中上游引物序列为seq id no.5所示，下游引物序列为seq id no.6所示；所述cpr基因的引物组中上游引物序列为seq id no.7所示，下游引物序列为seq id no.8所示；所述cyp6a8基因的引物组中上游引物序列为seq id no.9所示，下游引物序列为seq id no.10所示；所述sirt1基因的引物组中上游引物序列为seq id no.11所示，下游引物序列为seq id no.12所示；所述keap1基因的引物组中上游引物序列为seq id no.13所示，下游引物序列为seq idno.14所示；所述hsp22基因的引物组中上游引物序列为seq id no.15所示，下游引物序列为seq id no.16所示；所述hsp68基因的引物组中上游引物序列为seq id no.17所示，下游引物序列为seq id no.18所示；所述gstd6基因的引物组中上游引物序列为seq id no.19所示，下游引物序列为seq id no.20所示。
13、在本发明的一个优选实施例中，s4中所述评价中药配伍毒性变化趋势的方法为：
14、若s1所述中药培养基中的果蝇生存曲线呈上升趋势，表明该中药的毒性呈下降趋势；
15、若s2所述酶活性检测结果中乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活性升高、谷胱甘肽s-转移酶活性降低，表明该中药及其配伍后的毒性呈下降趋势；
16、若s3所述定量实时pcr检测结果中左金丸或吴茱萸汤培养基中培养的雌、雄果蝇的hsp83、gstd7基因表达上调、sirt1、phgpx基因表达下调，表明吴茱萸配伍成左金丸或吴茱萸汤后的毒性呈下降趋势；
17、若s3所述定量实时pcr检测结果中二神丸组和四神丸培养基中培养的雌、雄果蝇的hsp83、cpr、cyp6a8基因表达上调、sirt1、keap1、hsp22、hsp68、gstd6基因表达下调，表明补骨脂配伍成二神丸、四神丸后的毒性呈下降趋势；
18、所述吴茱萸及其配伍是指吴茱萸、左金丸或吴茱萸汤中的任意一项；
19、所述补骨脂及其配伍是指补骨脂、二神丸和四神丸中的任意一项。
20、本发明的目的之二在于提供上述构建方法获得的评价中药及其配伍毒性变化趋势的模型。
21、本发明的目的之三在于提供上述模型在评价吴茱萸和补骨脂及其配伍毒性变化趋势中的应用。
22、本发明的有益效果：本发明提供了一种基于果蝇模式生物评价中药配伍毒性变化趋势的模型，通过将雌、雄果蝇分别饲养于含有不同中药培养基和对照培养基的容器中，并对上述培养后的果蝇进行生存分析实验、对雌果蝇进行乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽s-转移酶活性检测，以及对果蝇中std7、phgpx、hsp83、cpr、cyp6a8、sirt1、keap1、hsp22、hsp68和gstd6基因表达情况进行检测；所述酶活性检测结果中乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活性升高、配伍后的中药对其升高趋势有抑制作用，和谷胱甘肽s-转移酶活性降低，配伍后的中药对其降低趋势有抑制作用，表明该中药配伍后的毒性呈下降趋势；所述定量实时pcr检测结果中吴茱萸汤组对hsp83、gstd7基因表达上调、sirt1、phgpx基因表达下调有抑制作用，表明吴茱萸配伍成吴茱萸汤后的毒性呈下降趋势；所述定量实时pcr检测结果中二神丸组、四神丸组对hsp83、cpr、cyp6a8基因表达上调、sirt1、keap1、hsp22、hsp68、gstd6基因。
23、本发明所提供的评价中药配伍毒性变化趋势的模型，能够在短时间内对中药提取物毒性变化做出综合评价，由于，果蝇具有价格低廉、饲养方便、繁殖速度快、遗传背景明确等优点，进一步提高了本发明的检测效率，降低了检测成本；由此可见，本发明所述模型具有快速准确评估、高效经济、操作简单的优良特点。
24、本发明所提供的评价中药配伍毒性变化趋势的模型，可应用于评价吴茱萸和补骨脂及其配伍的毒性变化趋势，构建新型的毒性评价方法，为毒性检测方法提供新思路。
1.一种基于果蝇模式生物评价中药配伍毒性变化趋势模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1中所述果蝇死亡数的检测方法为：将果蝇分别放入含有不同中药培养基的容器中，在24℃培养光照12h昼夜交替，每天统计果蝇的死亡数。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1中所述对照培养基的组成包括：52.5g玉米粉、27.5g蔗糖、20g酵母、8g琼脂、0.25ml丙酸和500ml超纯水；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s2中所述离心条件为：在4℃、8000g条件下离心10min，所述酶活性检测对象为乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽s-转移酶。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s3中所述待测基因包括：gstd7、phgpx、hsp83、cpr、cyp6a8、sirt1、keap1、hsp22、hsp68和gstd6基因；所述gstd7基因id为48340，所述phgpx基因id为38413；所述hsp83基因id为38389；所述cpr基因id为33883；所述cyp6a8基因id为36666；所述sirt1基因id为34708；所述keap1基因id为42062；所述hsp22基因id为6737407；所述hsp68基因id为42852；所述gstd6基因id为48339。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s4中所述评价中药配伍毒性变化趋势的方法为：
9.权利要求1至8任意一项所述构建方法获得的评价中药及其配伍毒性变化趋势的模型。
10.权利要求9所述的模型在评价吴茱萸和补骨脂及其配伍毒性变化趋势中的应用。
