本发明涉及干细胞治疗，尤其涉及一种修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
1、脑部疾病是当前社会环境下危害人民生命健康的主要元凶之一。其中，具有高发病率、高致残率、高致死率等特点的脑卒中已跃居我国居民死亡原因之首，其发病率还以8.3％的速度逐年递增，极大影响了人民的生命健康和生活质量。
2、大部分脑部疾病伴随着剧烈的氧化应激及炎症因子的释放。例如，缺血性脑卒中发病早期，脑内能量耗竭、离子失衡与兴奋性神经递质的产生会不断累计损伤，继而进入急性期，构成血脑屏障的脑内皮细胞及其上紧密连接被破坏，水肿情况逐渐加重。随后，炎症因子大量释放，病灶区域氧化自由基过度堆积，氧化应激损伤启动神经元受损凋亡，形成恶劣的疾病微环境。
3、近年来，干细胞移植在多种脑部疾病的治疗中有广泛的研究，比如吴宏辉等在干细胞作为基因载体靶向治疗缺血性脑卒中的研究进展(吴宏辉，许东航，高建青.干细胞作为基因载体靶向治疗缺血性脑卒中的研究进展[j].中国药学杂志，2023，58(9)：762-770.doi：10.11669/cpj.2023.09.002.)中提到“干细胞移植疗法在脑部疾病的治疗中表现出色，除自身的修复作用外，还可以利用干细胞作为药物/基因的靶向递送载体，调节卒中发生后的疾病微环境，促进神经再生”；但是疾病微环境中高水平的氧化应激给干细胞的存活带来了巨大的挑战，从而导致干细胞的治疗功能受到抑制。
4、而目前对于疾病微环境中干细胞的保护主要为在干细胞表面通过层层包被技术形成涂层，隔绝干细胞与微环境的交流。这种涂层因为屏蔽干细胞表面迁移蛋白而影响了干细胞发挥向脑部损伤区域的天然靶向功能，也可能改变干细胞的力学性质，从而干扰其变形和穿过血脑屏障的能力。
5、此外，可通过细胞连接载药纳米粒的“细胞背包”形式从而抵抗或缓解微环境。然而，“细胞背包”需强还原性试剂暴露连接位点，存在较大细胞毒性，并且连接的稳定性存疑。因此，在不改变干细胞力学性质和变形能力的前提下，提高干细胞对缺血性脑卒中的高氧化应激微环境的抗性，对其在缺血性脑卒中的靶向治疗具有很好的应用前景及重要的科学意义。
技术实现思路
1、针对本领域目前存在的不足之处，本发明提供了一种修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞及其制备方法和应用。通过具有抗氧化应激功能的脂质体涂层改造干细胞，在不增加干细胞力学性质的前提下改造干细胞，提高其在恶劣的疾病微环境中对高水平氧化应激的抗性。
2、为达到上述目的，具体技术方案如下：
3、本发明提供了一种提高干细胞抗氧化应激并保持干细胞力学性质和变形能力的涂层制备方法和应用。
4、一方面，本发明提供了一种修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)制备具有抗氧化应激功能的脂质体，所述脂质体中dope与dotap的摩尔比为1：0.25-4；比例过大或过小均会丧去与细胞膜融合的能力；
6、(2)将具有抗氧化应激功能的脂质体与干细胞共孵育，获得修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞；
7、共孵育时，具有抗氧化应激功能的脂质体的浓度为50-1000μg/ml。
8、若孵育浓度过小，不足以达到抗氧化应激的效果。
9、具体的，所述具有抗氧化应激功能的脂质体由以下材料混合制备而成：二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、dope-peg(聚乙二醇)-fitc、dope-peg-r1；
10、其中，r1为抗氧化基团。
11、优选的，所述抗氧化基团为以下至少一种：2，2，6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(tempo)、2，2，6,6-四甲基哌啶(temp)、5，5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)。
12、在本发明实施例中，抗氧化基团选取tempo作为示例，其他抗氧化基团拥有同样功能基团，也能够实现本发明的抗氧化的技术效果。
13、优选的，本发明实施例中选取所述脂质体中dope与dotap的摩尔比为1：2作为示例，具有优异的抗氧化dpph消除能力以及细胞保护作用，但不限于此。
14、具体的，所述dope-peg-r1由dope-peg-nhs(n-羟基琥珀酰亚胺酯)和氨基化的r1反生酰胺化反应得到。
15、具体的制备方法：dope-peg-nhs溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，加入氨基化r1和三乙胺，室温反应0.5h后，将产物滴到大量的冰乙醚中沉淀，抽滤，收集产物，真空干燥即得dope-peg-r1。
16、具体的，所述干细胞为以下至少一种：脐带来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、神经干细胞、诱导性多能干细胞、牙髓干细胞。
17、优选的，所述共孵育条件为37℃下孵育10-60min。孵育时间过短会导致融合数量低，孵育时间进一步延长无法增加融合数量。
18、本发明同样适用于提高其他细胞的抗氧化应激能力。
19、另一方面，本发明还提供了所述制备方法制备的修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞。
20、本发明还提供了所述修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞在制备治疗脑部相关疾病药物中的应用。
21、优选的，所述脑部相关疾病为缺血性脑卒中、创伤性脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默症、帕金森病等疾病。
22、本发明与现有技术相比，有益效果为：
23、(1)本发明通过简单优选dotap比例即可获得具有优异膜融合能力的抗氧化应激脂质体。
24、(2)本发明形成的抗氧化应激脂质体通过薄膜分散法制备，步骤操作简单，所得抗氧化应激脂质体粒度均一，pdi良好，且可修饰性广泛，包括但不限于tempo、temp、dmpo。
25、(3)本发明通过膜融合实现抗氧化涂层，相较于“凝胶涂层”形式的保护方法可以实现不改变干细胞力学性质和变形能力，以便其正常到达病灶。
26、(4)本发明通过膜融合实现抗氧化涂层，相较于“疏水插入”抗氧化基团形式的保护方法具有更优异的稳定性。
27、(5)本发明通过膜融合实现抗氧化涂层，相较于需要对细胞进行化学试剂处理从而暴露化学位点实现“细胞背包”形式的保护方法具有更优异的生物相容性。
28、(6)本发明形成的具有抗氧化应激功能的干细胞，不影响干细胞正常迁移，展现出相同的体内病灶靶向能力。
29、(7)本发明形成的具有抗氧化应激功能的干细胞，不影响干细胞正常增殖，展现出相同的增殖能力。
30、(8)本发明形成的具有抗氧化应激功能的干细胞，提高了干细胞旁分泌能力，增强了细胞治疗能力。
31、(9)本发明形成的具有抗氧化应激功能的干细胞，无需额外药物即可抵抗高活性氧微环境。
1.一种修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述具有抗氧化应激功能的脂质体由以下材料混合制备而成：dope、dotap、dope-peg-fitc、dope-peg-r1；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述抗氧化基团为以下至少一种：tempo、temp、dmpo。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述dope-peg-r1由dope-peg-nhs和氨基化的r1反生酰胺化反应得到。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为以下至少一种：脐带来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、神经干细胞、诱导性多能干细胞、牙髓干细胞。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在37℃下共孵育10-60min。
7.权利要求1～6任一项所述制备方法制备的修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞。
8.权利要求7所述修饰有柔性抗氧化应激涂层的干细胞在制备治疗脑部相关疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脑部相关疾病为缺血性脑卒中、创伤性脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默症或帕金森病。
