本发明涉及生物，尤其涉及一种富集哺乳动物组织中rna结合蛋白的方法及其鉴定方法。
背景技术：
1、rna与蛋白结合形成动态复合物rbps，其作用是相互的，一方面rbps调控rna的修饰、定位、翻译及稳定性等，另一方面rna也负责协调rbps的活性以实现特定功能和定位等。越来越多的研究表明，动态核糖核蛋白(rnps)中rna和rbps之间的相互作用对调节生物功能至关重要，如转录后基因表达过程和应激反应。各种rna-蛋白质相互作用错综繁复，最终形成了庞大的rna-蛋白质相互作用网络，调控复杂的细胞过程。rbps的异常或缺失是多种疾病发生发展的根源，如神经退行性疾病、肌肉萎缩疾病和癌症。因此系统的研究rna-蛋白质的相互作用可以加深对多种生物学进程的了解，鉴定和定量rbps也为疾病诊断标志物的探索指明新的方向。
2、现有技术有多种规模化rna-蛋白复合物富集鉴定方法，如基于poly(a)的方法、基于核苷酸类似物代谢标记串联点击化学的方法、基于相分离的方法以及化学标记的方法，广泛用于细胞内rna-蛋白相互作用的动态变化研究，大幅度提高了rbps的鉴定规模，为系统的蛋白质-rna相互作用研究开辟了新的研究途径。不难发现，这些方法使用254nm uv固定rna-蛋白相互作用；然而254nm紫外光的穿透力有限，限制了其在哺乳动物组织中的应用。细胞系是生物学研究中的重要工具，在生物学和医学研究中扮演着重要角色。但是细胞系无法代表组织样本中存在的异质性和复杂性，也不能反映肿瘤微环境；使用哺乳动物组织为研究对象更接近真实的生理环境，同时直接在疾病相关的组织上研究可以更直观准确的发现疾病与rbp的关系。近几年报道了哺乳动物组织中规模化富集鉴定rbps的方法。例如，hentze等人将小鼠组织切片(30μm厚度)后254nm uv交联，使用eric捕获mrbps，称为uv_eric；冷冻切片可能改变生理条件下的真实分子间相互作用，从而区别于整个组织的交联。fax-ric方法使用甲醛交联小鼠肝脏组织后进行蛋白酶消化，rna上保留下交联肽，通过寡核苷酸(dt)捕获，选择性富集出mrbps；仅鉴定出119种信使核糖核酸结合蛋白(mrbps)。需要明确的是，尽管甲醛已被用于交联rna-蛋白质相互作用，但甲醛的高反应性导致较差的选择性。具体而言，rna与rna直接相互作用的rbps和直接结合rbps的rna间接结合蛋白(ribps)均可被甲醛共价交联，这些蛋白质统称为rna相关蛋白(raps)。hypr-ms方法将冷冻组织样本甲醛交联后富集鉴定mrbps及其结合蛋白；同样的，faxrap方法利用甲醛交联后的小鼠组织富集鉴定mrbps及其结合蛋白。纵观这四种方法，主要是针对mrna结合蛋白的研究，遗漏了同样具有重要生物学功能的非编码rna结合蛋白的信息；faxrap和hypr-ms方法无法区分直接和间接与rna结合的蛋白质。此外，这些方法无法原位固定rna-蛋白相互作用，这可能会影响生理条件下的分子相互作用特征。基于此，目前的最大挑战是将弱且动态的rna-蛋白质相互作用原位交联，并在哺乳动物中特异性捕获rbps及规模化鉴定。因此，迫切需要发展新技术以实现哺乳动物组织rna-rbps的原位交联和rbps规模化富集鉴定，从而全面系统的表征哺乳动物组织中rna-蛋白相互作用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于双交联串联巯基-炔基点击化学反应特异性富集哺乳动物组织中rna结合蛋白的方法，能够全面系统的表征哺乳动物组织中rna-蛋白相互作用。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种基于双交联串联巯基-炔基点击化学反应特异性富集哺乳动物组织中rna结合蛋白的方法，包括如下步骤：
4、(1)通过代谢标记的方式在哺乳动物的rna上引入炔烃修饰；
5、(2)对炔烃修饰后的小鼠依次进行原位pbs和甲醛灌注，以原位交联哺乳动物中的rna-蛋白及dna/蛋白-蛋白相互作用；
6、(3)取甲醛灌注后的组织封闭游离巯基，组织裂解后，基于巯基-炔基点击化学反应对所述rna进行生物素化标记，得到生物素标记rna；
7、(4)用254nm紫外线对生物素标记rna和rbps进行特异性交联，固定rnps；
8、(5)所述特异性交联后升温，使甲醛解交联；
9、(6)所述解交联后进行富集、洗脱后得到富集产物rbps；
10、(7)对所述富集产物rbps进行sds-page和质谱分析。
11、优选的，步骤(1)所述炔烃修饰试剂为炔烃尿苷类似物，所述炔烃尿苷类似物的代谢标记时间为1～5h，浓度为13～17mg/ml。
12、优选的，步骤(2)所述pbs原位灌注的流速为3800～4200μl/min，灌注至血液除尽；所述甲醛灌注时，甲醛pbs溶液的浓度为0.05～0.3％，灌注流速为3800～4200μl/min，灌注时间为8～12min；所述甲醛灌注包括甲醛原位灌注和甲醛非原位灌注两种方式；所述甲醛原位灌注是在pbs原位灌注后进行，所述甲醛非原位灌注是在pbs原位灌注后摘取组织，对所述组织切片后进行甲醛灌注。
13、优选的，步骤(3)所述封闭游离巯基是采用n-乙基马来酰亚胺溶液进行封闭，所述n-乙基马来酰亚胺溶液浓度为100～200mm，封闭时长为15～35min。
14、优选的，步骤(3)巯基-炔基点击化学反应中的巯基试剂为sh-peg11-biotin和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐；所述sh-peg11-biotin加入裂解液后的终浓度为300～500μm，所述偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐加入裂解液后的终浓度为30～50μm。
15、优选的，步骤(3)所述巯基-炔基点击化学反应的条件为冰上365nm紫外灯照射，所述紫外灯照射的时长为0.5～4min，所述紫外灯的功率为50～150w。
16、优选的，步骤(4)所述254nm波长紫外光照能量为0.15-0.5j/cm2。
17、优选的，步骤(5)所述升温是将温度升至50～70℃并维持0.5～1.5h。
18、优选的，步骤(6)所述富集借助链霉亲和素磁珠对rnps进行富集，所述链霉亲和素磁珠的体积为50～100μl；富集时间为30～120min；所述洗脱是借助rnasea酶解洗脱rbps，rnasea溶液的浓度为0.05～0.15μg/μl，酶解的温度为35～40℃，时间为0.5～3h。
19、本发明还提供了一种rna结合蛋白的鉴定方法，包括如下步骤：
20、(1)将权利要求1～9任一项得到的富集产物rbps分为实验组和对照组，所述对照组是将富集产物rbps先用浓度为0.1～0.2μg/μl的rnasea溶液在35～40℃下酶解0.5～3h，与所述对照组相比，实验组没有用浓度为0.1～0.2μg/μl的rnasea溶液在35～40℃下酶解0.5～3h的步骤；
21、(2)将所述实验组和所述对照组分别进行胰酶酶解、回收肽段及肽段脱盐；
22、(3)脱盐后，所述实验组使用甲醛标记，所述对照组使用氘代甲醛标记，两组混合后进行质谱鉴定；
23、(4)分析质谱数据，得到rna结合蛋白的鉴定结果。
24、本发明提供的基于双交联串联巯基-炔基点击化学反应特异性富集哺乳动物组织中rna结合蛋白的方法，利用甲醛的高透膜性，通过灌注方式(原位)交联rna-蛋白以及dna/蛋白-蛋白相互作用，同时代谢标记小鼠体内所有类型rna，使用绿色、高效的巯基-炔基点击化学生物素化所有种类rna用于后续富集，而交联的dna/蛋白-蛋白复合物不能被生物素化标记从而后续无法富集；接着使用特异性交联剂254nm uv进一步交联rna和rbps，再利用甲醛交联的高温不稳定性，升高温度解离产生的甲醛交联，即破坏dna/蛋白质-蛋白质复合物以及rbps和ribps间的共价交联；最后根据链霉亲和素与生物素间的强相互作用，使用链霉亲和素磁珠特异性捕获rna以及与其相互作用的rbps，使用rnase洗脱得到rbps进行sds-page分析和蛋白质组学样品制备、质谱鉴定分析。
25、与现有的哺乳动物组织中rbps富集鉴定方法相比，本发明的方法具有以下优势：
26、1)代谢标记，精准标记rna，即仅rna上有炔基修饰，进一步的生物素化rna，因此在富集时，精准捕获rna及与其相互作用的rbps，可轻松排除dna/蛋白-蛋白复合物的干扰；
27、2)两种交联剂配合使用，甲醛首先在哺乳动物体内固定rna-rbps-ribps以及dna/蛋白-蛋白相互作用，裂解液中254nmuv特异性交联rna-rbps相互作用，升温破坏甲醛产生的交联以排除ribps以及其他蛋白的干扰，从而可以真实反映体内rna-蛋白相互作用；解决了甲醛交联特异性低的难题，也克服了哺乳动物组织层面紫外光交联穿透力弱的阻碍。
28、3)甲醛交联与光交联有不同的碱基偏好性，根据甲醛交联的机理，含有氨基的碱基(a，c和g)都能与蛋白交联，紫外光交联倾向于嘧啶碱基(c或u)；两种交联剂互不干扰且相互配合，以实现最大化的rna-蛋白特异性交联。
29、4)无金属催化的巯基-炔基点击化学反应由外部光激发，时间快速，分钟级别的rna-蛋白复合物标记能力；同时无需铜催化，避免由于金属毒性造成的rna降解，实现哺乳动物组织中rna的无损标记和rbps的全面富集鉴定。
1.一种基于双交联串联巯基-炔基点击化学反应特异性富集哺乳动物组织中rna结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述炔烃修饰试剂为炔烃尿苷类似物，所述炔烃尿苷类似物的代谢标记时间为1～5h，浓度为13～17mg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述pbs原位灌注的流速为3800～4200μl/min，灌注至血液除尽；所述甲醛灌注包括甲醛原位灌注和甲醛非原位灌注两种方式；所述甲醛原位灌注是在pbs原位灌注后进行，所述甲醛原位灌注时，甲醛pbs溶液的浓度为0.05～0.3％，灌注流速为3800～4200μl/min，灌注时间为8～12min；所述甲醛非原位灌注是在pbs原位灌注后摘取组织，对所述组织切片后进行甲醛交联，甲醛pbs溶液的浓度为0.05～0.3％，交联温度为20～25℃，交联时间为8～12min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述封闭游离巯基是采用n-乙基马来酰亚胺溶液进行封闭，所述n-乙基马来酰亚胺溶液浓度为100～200mm，封闭时长为15～35min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)巯基-炔基点击化学反应中的巯基试剂为sh-peg11-biotin和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐；所述sh-peg11-biotin加入裂解液后的终浓度为300～500μm，所述偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐加入裂解液后的终浓度为30～50μm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述巯基-炔基点击化学反应的条件为冰上365nm紫外灯照射，所述紫外灯照射的时长为0.5～4min，所述紫外灯的功率为50～150w。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述254nm波长紫外光照能量为0.15-0.5j/cm2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述升温是将温度升至50～70℃并维持0.5～1.5h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述富集借助链霉亲和素磁珠对rnps进行富集，所述链霉亲和素磁珠的体积为50～100μl；富集时间为30～120min；所述洗脱是借助rnasea酶解洗脱rbps，rnase a溶液的浓度为0.05～0.15μg/μl，酶解的温度为35～40℃，时间为0.5～3h。
10.一种rna结合蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
