本申请属于药物制备领域，尤其涉及hgf/cat双基因纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术：
1、下肢缺血性疾病是指血管周围部分或全部闭塞，导致疼痛、溃疡和坏疽等症状。这种疾病发病率高、致残率高、死亡率高，影响全球约10％的人口。尽管手术和血管内治疗取得了进步，但满足患者的临床需求仍然具有挑战性。迫切需要进一步改善缺血性肢体损伤的治疗，降低致残率和死亡率，提高患者的生活质量。
2、下肢缺血的主要问题是腿部肌肉和软组织血流灌注减少。治疗性血管生成为下肢缺血的治疗提供了一种新的方法，特别是通过基因治疗促进缺血侧支循环的发展，如肝细胞生长因子质粒(phgf)治疗，可有效减轻下肢缺血。然而，受单基因治疗的局限性和基因转染低效率的影响，这类技术在下肢缺血治疗中的应用尚处于临床研究阶段。需要进一步的研究来增强对基因治疗促进血管生成的认识。
3、因此本研究开发了一种基于膜融合脂质体-核靶向聚合物杂化纳米载体，包载phgf与pcat的双基因纳米药物，用于治疗下肢缺血性疾病。
技术实现思路
1、本申请提供一种hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，解决上述问题。
2、本发明所采用的技术方案如下：
3、一种hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将肝细胞生长因子质粒和过氧化氢酶质粒加入溶剂中，再加入pva溶液，制得hgf/cat-nps混悬液；
5、(2)将hgf/cat-nps混悬液和anti-lmnb1抗体混合，制得hgf/cat-nps+b混悬液；
6、(3)将hgf/cat-nps+b混悬液加入脂质膜中，制得hgf/cat-lnps混悬液；
7、(4)将hgf/cat-lnps混悬液和hvj-e混合，制得成品。
8、进一步的，步骤(1)中，所述肝细胞生长因子质粒和过氧化氢酶质粒的质量比为1:0.8～1.2。
9、进一步的，步骤(1)中，所述溶剂包括硫酸鱼精蛋白、聚乳酸羟基乙酸共聚物、二氯甲烷和水。
10、进一步的，将2.5～3.5mg硫酸鱼精蛋白加入水中，制得硫酸鱼精蛋白水溶液，将硫酸鱼精蛋白水溶液加入含有70～90mg聚乳酸羟基乙酸共聚物的二氯甲烷中，采用20000rpm/min在冰浴中搅拌4～6min，制得溶剂。
11、进一步的，将含有促肝细胞生长素和过氧化酶的蒸馏水一边搅拌一边缓慢加入溶剂中，然后加入15ml的1％ pva(聚乙烯醇)溶液中混合。将所得混合物搅拌并蒸发3小时以去除二氯甲烷，得到hgf/cat-nps。
12、进一步的，步骤(2)中，所述anti-lmnb1抗体和促肝细胞生长素比例为9～11μl：0.9～1.1mg。
13、进一步的，步骤(2)中，所述hgf/cat-nps混悬液和anti-lmnb1抗体采用90～110rpm/min振荡4-6min。
14、进一步的，步骤(3)中，所述脂质膜采用蛋黄卵磷脂、二油酰基-三甲基氯化铵、胆固醇和二氯甲烷制得。
15、进一步的，将含有2mg蛋黄卵磷脂、2mg二油酰基-三甲基氯化铵和1mg胆固醇的二氯甲烷在65℃蒸发形成脂质膜。
16、进一步的，步骤(4)中，所述hvj-e和促肝细胞生长素比例为45～55μl：0.9～1.1mg。
17、进一步的，步骤(4)中将hgf/cat-lnps混悬液和hvj-e采用13000～17000rpm/min离心混合。
18、进一步的，hgf/cat双基因纳米药物在制备下肢缺血性疾病药物中的应用。
19、本申请实施例与现有技术相比的有益效果是：
20、本申请将肝细胞生长因子质粒(phgf)和过氧化氢酶质粒(pcat)包封以制备双基因纳米粒(hgf/cat-flnps)。在制备过程中加入聚乳酸-羟基乙酸，并且将抗核纤层蛋白b1抗体和聚乳酸-羟基乙酸结合，通过抗原抗体反应靶向细胞核，实现内载基因向细胞核的高效递送。
21、本申请中采用蛋黄卵磷脂、二油酰基-三甲基氯化铵、胆固醇和二氯甲烷制备脂质体，将脂质体加入hgf/cat双基因纳米药物的制备中，能够解决聚乳酸-羟基乙酸由于表面带负电荷以及较低的溶酶体逃逸效率导致基因转染低的问题，进一步提高hgf/cat双基因纳米药物的递送效率。
22、在制备hgf/cat双基因纳米药物过程中加入吸附仙台病毒包膜蛋白(hvj-e)能够提高各个组分的融合效果，提高药物对下肢缺血性疾病的治疗效果。
1.一种hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肝细胞生长因子质粒和过氧化氢酶质粒的质量比为1:0.8～1.2。
3.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂包括硫酸鱼精蛋白、聚乳酸羟基乙酸共聚物、二氯甲烷和水。
4.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述anti-lmnb1抗体和肝细胞生长因子质粒比例为9～11μl：0.9～1.1mg。
5.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合为采用90～110rpm/min进行振荡混合。
6.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脂质膜采用蛋黄卵磷脂、二油酰基-三甲基氯化铵、胆固醇和二氯甲烷制得。
7.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述hvj-e和肝细胞生长因子质粒比例为45～55μl：0.9～1.1mg。
8.如权利要求1所述的hgf/cat双基因纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心的转速为13000～17000rpm/min。
9.一种hgf/cat双基因纳米药物，其特征在于，通过权利要求1-8中任一项所述的制备方法获得。
10.如权利要求9所述的hgf/cat双基因纳米药物在制备下肢缺血性疾病药物中的应用。
