本发明属于植物基因工程，具体的说是提供了一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统和应用。
背景技术：
1、条斑紫菜以其鲜美口感和丰富的营养价值著称，富含多种氨基酸和维生素，在食用和保健领域都具有极高的价值，是全球单位产值最高的经济海藻。然而，传统育种方法依赖于漫长的选育过程，效率低下，难以满足人们对优质品种日益增长的需求。除了经济价值外，条斑紫菜独特的生命周期和重要的进化地位，使其在光合生物研究中具有与酵母菌同等重要的地位，被誉为未来海藻研究的理论模型。然而，由于缺乏反向遗传操作技术，条斑紫菜的分子机制研究长期停滞不前，难以取得突破。因此，开发先进的技术手段对于推动大型海藻产业发展和理论研究都至关重要。
2、crispr/cas基因编辑技术作为近年来兴起的革命性技术，经过飞速发展，已衍生出包括crispr/cas9、crispr/cas12a和crispr/cas13a在内的多个基因编辑系统，并在动物、植物和微生物领域取得了重大突破。例如，水稻中利用基因编辑技术已培育出抗病高产的品种，大豆中也通过基因编辑育种获得了高蛋白产量品种。基因编辑育种技术具有靶向性强、效率高等优点，已成为高等植物育种领域最先进的手段。然而，大型经济海藻的基因编辑研究相对滞后，鲜有利用crispr/cas系统进行基因编辑的报道。2021年，badis等人首次报道了大型褐藻基因编辑的成功案例，他们利用核糖核蛋白(rnp)递送方式，使用crispr/cas9对长囊水云进行了基因编辑。反观条斑紫菜，由于基因组较高的基因组gc含量(66％)、含有大量的长非编码序列以及对外源基因表达沉默现象，导致没有建立起一套真对该物种的完善高效的遗传操作工具。条斑紫菜长期处于正向遗传学研究阶段，高质量的基因组2020年才获得，近几年才陆续开展了有限的分子功能研究。条斑紫菜基因编辑技术一直停滞不前，导致无法开展反向遗传学研究，严重阻碍了其基础研究和产业发展。
3、crispr/cas9系统作为当前最广泛应用、效率最高的基因编辑系统，备受期待。其工作原理是利用cas9核酸酶在grna的引导下，对特定靶位点进行精准切割。这种切割会引发细胞的非同源末端连接修复(nhej)机制，nhej修复过程中存在碱基删除或插入的可能性，从而导致靶位点发生突变，实现精确的基因编辑。crispr/cas9系统的核心元件是cas9核酸酶和grna，只有当两者在细胞内成功表达并形成核糖核蛋白(rnp)复合物，才能将cas9引导至靶点发挥作用。由于条斑紫菜中缺乏合适的靶点编辑标记，难以采用rnp递送方式进行基因编辑，只能选择质粒系统等稳定遗传转化方式，但crispr/cas9质粒系统构建时，需要调控cas9表达和grna表达的重要的元件。因此，怎样得到这些元件并成功实现表达是实现条斑紫菜基因编辑的重要基础条件。
技术实现思路
1、为了突破条斑紫菜育种技术瓶颈，本发明旨在提供一种大型海藻条斑紫菜crispr/cas9基因编辑系统和应用。
2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
3、一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统，系统含有驱动cas9和grna表达的启动子的质粒载体；
4、所述驱动grna表达的聚合酶ⅲ型启动子为pypu6，具有序列表sediq no.1中所示的碱基序列；
5、所述cas9为密码子优化后的pycas9基因，具有序列表sediq no.2中所示的碱基序列。
6、所述质粒中驱动外源基因pycas9表达的强启动子为pypubi1，具有序列表sediqno.3中所示的碱基序列。
7、所述大型海藻为条斑紫菜。
8、一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统的构建方法，
9、1)根据大型海藻密码子偏好性，对cas9基因进行密码子优化得到pycas9；
10、2)克隆大型海藻强启动子pypubi1用于外源基因表达，并构建pypubi1::pycas9-p2a-gus-nost表达模式，通过gus染色判定pycas9表达正常；
11、3)克隆大型海藻iii型启动子pypu6和其终止子pyu6t，并构建pypu6::gus-u6t，通过gus染色判定启动子功能正常；
12、4)根据上述构建含pypubi1::pycas9-p2a-hyg-nost和pypu6::grna-u6t表达模块的质粒(pv5py62)，即大型海藻基因编辑系统。
13、所述步骤4)使用了优化后的2a肽，p2a具有序列表sediq no.4中所示的碱基序列；
14、所述步骤3)终止子pyu6t具有序列表sediq no.5中所示的碱基序列；
15、所述步骤4)所构建的质粒pv5py62，具有序列表sediq no.6中所示的碱基序列。
16、所述在步骤4)中采用内源强启动子对cas9核酸酶进行表达，同时使用自剪切肽p2a连接潮霉素抗性基因hyg与cas9核酸酶，实现富集筛选，大大提高了筛选基因敲除突变体的效率。
17、一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统的应用，所述系统在构建大型海藻基因编辑工程植株中的应用。
18、一种基因编辑植株，植株为大型海藻，其含所述系统。
19、通过基因枪轰击技术将基因编辑转化到大型海藻细胞内；随后，利用潮霉素抗性筛选，成功获得了基因编辑植株。
20、针对上述大型海藻(条斑紫菜)构建基于crispr/cas9基因编辑系统的反向遗传学操作方法，具体步骤如下：
21、1)根据条斑紫菜密码子偏好性对cas9进行序列优化得到pycas9，克隆并鉴定条斑紫菜中的聚合酶ii(polⅱ)型启动子，以期用于驱动pycas9表达。
22、2)克隆并鉴定条斑紫菜中的聚合酶iii型(polⅲ)启动子以期用于驱动grna表达。
23、3)利用上述启动子构建同时表达cas9核酸酶和grna的载体质粒。该质粒通过自剪切肽p2a技术将潮霉素抗性基因hyg与cas9串联表达，实现富集筛选。
24、4)利用基因枪将构建好的质粒导入条斑紫菜配子体叶片细胞。
25、5)通过潮霉素b抗性筛选获得转基因单克隆藻株。
26、6)通过快速提取dna方法获取抗性藻株的基因组dna。
27、7)利用sanger测序和高通量测序技术验证抗性藻株发生的基因编辑特征。
28、本发明针对大型海藻通过将表达cas9核酸酶和引导rna的载体导入藻株，实现靶基因精准编辑，成功获得基因敲除突变体。本发明具有如下优点：
29、1.使用内源的polⅲ和polⅱ启动子进行表达，降低了基因表达时受到的宿主抑制的风险；
30、2.使用自剪切肽p2a将cas9和hyg进行多顺反子串联，提高了阳性筛选的成功率；
31、3.使用快速提取dna的方法进行阳性藻株验证，大大提高了生产效率。
1.一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于：系统含有驱动cas9和grna表达的启动子的载体质粒；
2.根据权利要求1所述的大型海藻crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于：所述质粒中含驱动外源基因表达的强启动子为pyubi1，其具有序列表sediq no.3中所示的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的大型海藻crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于：所述大型海藻为条斑紫菜。
4.一种大型海藻crispr/cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的大型海藻条斑紫菜crispr/cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中优化了2a肽，即p2a具有序列表sediq no.4中所示的碱基序列。
6.根据权利要求4所述的大型海藻条斑紫菜crispr/cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中终止子pyu6t，具有序列表sediq no.5中所示的碱基序列。
7.根据权利要求4所述的大型海藻条斑紫菜的基因编辑系统，其特征在于步骤4)所构建的质粒pv5py62，具有序列表sediq no.6中所示的碱基序列。
8.一种权利要求1所述的大型海藻crispr/cas9基因编辑系统的应用，其特征在于：所述系统在构建大型海藻基因编辑工程植株中的应用。
9.一种基因编辑植株，其特征在于，植株为大型海藻，其含有权利要求1所述系统。
10.根据权利要求8所述的植株，其特征在于：通过基因枪轰击技术将基因编辑转化到大型海藻细胞内；随后，利用潮霉素抗性筛选，成功获得了基因编辑植株。
