2-叔丁氧羰基氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法与流程

2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法
技术领域
1.本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法。


背景技术：

2.拉考沙胺(lacosamide)，化学名：(r)-2-乙酰胺基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺，是一种新型n-甲基-d-天门冬氨酸(nmda)受体甘氨酸位点结合拮抗剂，主要用于治疗癫痫和神经性疼痛。
3.目前，拉考沙胺大多采用以下的工艺路线合成：
[0004][0005]
其中，(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺(int3)是拉考沙胺合成中的重要中间体，在其合成的过程中，不可避免地会出现(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺(对映异构体)。(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺为工艺杂质，对于抑制癫痫作用不明，如果不进行有效控制，在后续合成拉考沙胺的过程中int3异构体会继续参与反应产生新的异构体杂质，进而影响拉考沙胺的质量，因此，对(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺进行质量控制是保证拉考沙胺药物质量的关键。
[0006]
目前现有技术中尚未关于2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法的报道，因此，开发一种便捷、高效、准确地对2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体进行定量检测的方法是目前亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明提供一种2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法，从而监测拉考沙胺的质量稳定性，以提高临床用药安全性。
[0008]
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
[0009]
一种2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法，包括如下步骤：
[0010]
配置待测溶液；
[0011]
采用高效液相色谱法对所述待测溶液进行检测，色谱条件包括：
[0012]
色谱柱：以直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷硅胶为填充剂的色谱柱，
[0013]
流动相：正己烷和乙醇的混合溶液，所述正己烷与所述乙醇的体积比为(78-82):(18-22)。
[0014]
在制备(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺(int3)的过程中，不可避免地会产生多种工艺杂质，因此，在对(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺(int3异构体杂质)进行检测的过程中，int3及其他的工艺杂质会产生干扰，如何避免int3及其他杂质的干扰是对int3的异构体杂质进行准确、定量检测的关键。发明人经深入研究发现，通过采用特定的以直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷硅胶为填充剂的手性色谱柱，结合由正己烷与乙醇以(78-82):(18-22)的体积比构成的混合溶液作为流动相，能够有效减少甚至避免其他工艺杂质的干扰，实现int3与int3异构体的有效分离，准确地对int3与int3异构体杂质进行定量检测。
[0015]
本发明提供的2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法，从专属性、检测限和定量限、线性、回收率、重复性、溶液稳定性和耐用性等方面进行了验证，均符合要求。本发明提供的检测方法灵敏度、准确度、重现性、回收率和稳定性好，检测结果准确可靠，为监控拉考沙胺药品的质量稳定性和提高临床用药安全性提供了保证。
[0016]
可选地，所述供试品溶液中所述int3的浓度为(1.0-2.0)mg/ml；优选地，所述供试品溶液中所述int3的浓度为1.5mg/ml。
[0017]
通过限定供试品溶液的浓度使得int3、int3异构体及其他杂质的峰形更好，柱效更高，积分更准确，从而有利于对供试品中int3、int3异构体杂质及其他杂质的有效分离，以及对int3、int3异构体杂质的含量进行更准确的计算。
[0018]
优选地，所述正己烷与所述乙醇的体积比为80:20。
[0019]
可选地，所述色谱柱为ad-h柱。
[0020]
可选地，检测波长为200-210nm。
[0021]
优选地，所述检测波长为205nm。
[0022]
可选地，柱温为20-30℃。
[0023]
优选地，所述柱温为30℃。
[0024]
可选地，流速为0.9-1.1ml/min。
[0025]
优选地，所述流速为1.0ml/min。
[0026]
可选地，进样量为8-12μl；优选地，所述进样量为10μl。
[0027]
通过对检测波长、柱温、流速及进样量等进行限定，可进一步提高int3与int3异构体杂质及其他工艺杂质的分离度。
[0028]
可选地，所述待测溶液包括供试品溶液和对照溶液的制备，所述对照溶液中包括(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺和(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺。
[0029]
可选地，所述对照溶液中所述(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺的浓度为(1.0-2.0)mg/ml，所述(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺的浓度为(80-120)μg/ml。
[0030]
优选地，所述对照溶液中所述(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺的浓度为1.5mg/ml，所述(s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺的浓度为105μg/ml。
[0031]
通过限定对照品混合溶液中各物质的浓度，便于准确地对供试品溶液中int3及int3异构体杂质进行定位。
附图说明
[0032]
图1为实施例1中流动相1)的供试品与对照品混合溶液的液相色谱图；
[0033]
图2为实施例1中流动相1)的int3异构体定位溶液的液相色谱图；
[0034]
图3为实施例1中流动相1)的int3-6定位溶液的液相色谱图；
[0035]
图4为实施例1中流动相2)的供试品与对照品混合溶液的液相色谱图；
[0036]
图5为实施例1中流动相3)的供试品与对照品混合溶液的液相色谱图；
[0037]
图6为实施例1中流动相3)的int3-6定位溶液的液相色谱图；
[0038]
图7为实施例1中流动相4)的供试品与对照品混合溶液的液相色谱图；
[0039]
图8为实施例1中流动相4)的int3-6定位溶液的液相色谱图；
[0040]
图9为实施例1专属性中空白溶剂的液相色谱图；
[0041]
图10为实施例1专属性中供试品与int3异构体的混合溶液的液相色谱图。
具体实施方式
[0042]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043]
现有的拉考沙胺的工艺路线，在合成int3时会产生多种杂质，包括没有反应完的int2、苄胺，以及int3异构体((s)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺)、int3-6、二苄胺、苯甲醇、苯甲醛和杂质i等。由于int3及其异构体的极性比较相似，再加上其他杂质的干扰，这对int3及其异构体有效分离及定量检测造成了很大的困难。
[0044]
其中，int3-6、杂质i的结构如下：
[0045][0046]
发明人经深入研究分析最终确定了如下的检测方法：
[0047]
取(r)-2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺用流动相溶解，制得浓度为(1.0-2.0)mg/ml供试品溶液；
[0048]
采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测，色谱条件如下：
[0049]
色谱柱：大赛璐ad-h柱；
[0050]
流动相：正己烷和乙醇的混合溶液，所述正己烷与所述乙醇的体积比为(78-82):(18-22)；
[0051]
检测波长：200-210nm；
[0052]
柱温：20-30℃；
[0053]
流速：0.9-1.1ml/min。
[0054]
进样量：8-12μl。
[0055]
该方法能够避免各杂质对int3及其异构体的干扰，实现int3及其异构体的有效分离及准确定量，为监控拉考沙胺药品质量的稳定性和提高用药安全性提供了保障。
[0056]
实施例1：
[0057]
2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法的筛选：
[0058]
1.1溶液配制
[0059]
供试品溶液的配制：精密称取int3适量，加溶剂溶解并稀释至每1ml中含有1.5mg int3的溶液，即得。
[0060]
各定位溶液的配制：精密称取int3(供试品)，int2、苄胺、int3异构体、int3-6、二苄胺、苯甲醇、苯甲醛和杂质i对照品适量，分别用溶剂溶解并稀释成每1ml约含int3 1.5mg、int2 500μg、苄胺200μg、int3异构体80μg、int3-6 200μg、二苄胺200μg、苯甲醇200μg、苯甲醛200μg和杂质i 200μg的溶液，即得各定位溶液。
[0061]
对照溶液的制备：分别精密称取int3、int3异构体的对照品适量，用溶剂分别溶解并稀释、混合至每1ml中约含int3 1.5mg、int3异构体105μg的混合溶液，即得对照溶液(供试品与int3异构体的混合溶液)。
[0062]
上述各溶液配制过程中均采用正己烷-乙醇(体积比为80:20)的混合溶液溶解、稀释。
[0063]
上述中苄胺、二苄胺、苯甲醇、苯甲醛和杂质i对照品均是采用市售产品。int3(供试品)、int2均采用背景技术部分的合成方法制备。int3异构体的制备方法与int3的制备方法类似，区别仅在于制备int3异构体的起始原料采用l-丝氨酸；int3-6与int3的制备方法类似，区别仅在制备int3-6时将合成int1时的boc酸酐替换成异丁酸酐。
[0064]
1.2检测方法的筛选
[0065]
此处只列举液相条件筛选过程中部分杂质的影响及部分流动相的筛选。
[0066]
1.2.1拟筛选的检测方法：
[0067]
色谱柱：大赛璐ad-h柱，规格：4.6mm
×
250mm，5μm；
[0068]
检测波长；205nm；
[0069]
柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：10μl。
[0070]
流动相1)正己烷-乙醇体积比为10：90，洗脱时间15min；
[0071]
流动相2)正己烷-乙醇体积比为40：60，洗脱时间15min；
[0072]
流动相3)正己烷-乙醇体积比为65：35，洗脱时间30min；
[0073]
流动相4)正己烷-乙醇体积比为80：20，洗脱时间40min。
[0074]
1.2.2部分筛选过程
[0075]
取供试品与对照品混合溶液、各定位溶液，按照上述色谱条件分别进行检测。其
中，流动相1)对应的供试品与对照品混合溶液、int3异构体定位溶液、int3-6定位溶液的色谱图如图1-3所示；流动相2)对应的供试品与对照品混合溶液的色谱图如图4所示；流动相3)对应的供试品与对照品混合溶液、int3-6定位溶液的色谱图如图5-6所示；流动相4)对应的供试品与对照品混合溶液、int3-6定位溶液的色谱图如图7-8所示。
[0076]
由附图1-3可知，流动相1)的条件下，int3异构体定位溶液中int3异构体的出峰时间为6.493min，int3-6定位溶液中int3-6的出峰时间为6.363min，供试品与对照品混合溶液中int3-6与int3异构体的出峰重合，出峰时间为6.487min。说明流动相1)的色谱条件下int3异构体与int3-6的不能有效分离，int3-6干扰int3异构体的检测。
[0077]
流动相2)的条件下，int3异构体与int3-6的出峰重叠，具体见附图4所示，说明流动相2)的条件下int3-6干扰int3异构体的检测。
[0078]
由附图5-6可知，流动相3)的条件下，int3-6定位溶液中int3-6的出峰时间为9.793min，供试品与对照品混合溶液中int3-6出峰时间为8.853min，int3异构体的出峰时间为9.377min，说明流动相3)的色谱条件下能够将int3异构体与杂质int3-6分离开，但是分离度较差，不能实现int3异构体的准确定量。
[0079]
流动相4)的条件下，由附图7-8可知，int3-6定位溶液中int3-6的出峰时间为16.383min，供试品与对照品混合溶液中int3-6出峰时间为16.903min，int3异构体的出峰时间为15.423min，说明流动相4)的色谱条件下能够将int3异构体与杂质int3-6进行有效分离，且其他各杂质均不影响分离效果，能够实现int3异构体的准确定量。
[0080]
1.2.3最终确定的检测方法
[0081]
色谱柱：大赛璐ad-h柱，规格：4.6mm
×
250mm，5μm；
[0082]
检测波长；205nm；
[0083]
柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：10μl；
[0084]
流动相：正己烷-乙醇(体积比为80：20)的混合溶液。
[0085]
1.3上述最终确定的检测方法的方法学验证
[0086]
方法学验证采用纯度最优的一批int3供试品。
[0087]
(1)专属性考察
[0088]
取空白溶剂(流动相)、供试品与int3异构体的混合溶液、各定位溶液，按1.2.3中的检测条件分别进进行检测，其中，空白溶剂的色谱图如图9所示，供试品与int3异构体的混合溶液的色谱图如图10所示，结果见下表1。
[0089]
表1专属性测试结果
[0090][0091]
上述结果表明，空白溶剂不干扰int3及int3异构体的检测，各杂质与int3的分离度良好，且各杂质与int3、int3异构体之间均无干扰，满足专属性要求，本发明提供的2-叔丁氧羰基氨基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺异构体的检测方法专属性良好。
[0092]
(2)检测限和定量限考察
[0093]
分别精密称取int3及int3异构体适量，分别用流动相溶解并稀释得到不同浓度的int3及int3异构体溶液，然后按1.2.3中的检测条件进行检测；并将信噪比约为10：1时的分析物浓度为其定量限浓度，在此浓度条件下连续进样6针；将得到信噪比约为3：1的分析物浓度设为其检测限浓度，具体检测结果见下表。
[0094]
表2-1定量限和检测限结果
[0095][0096]
注：相当于样品％指的是各物质占供试品溶液中int3含量的比例。
[0097]
表2-2定量限重复性结果
[0098]
成分123456rsd％int35662975487585665375580705595045440721.64int3异构体5530135613685559105541495525815586400.62
[0099]
由上表中的数据可知，定量限溶液重复进样6次，各物质的峰面积的rsd最大为1.64％，且int3及int3异构体的定量限和检测限均是微克级，说明本发明提供的检测方法灵敏度高，定量限重复性良好，能够对供试品中的int3及int3异构体进行准确、定量地检测。
[0100]
(3)线性考察
[0101]
称取int3和int3异构体各87.5mg，精密称定，分别置50ml量瓶中，用流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为int3及int3异构体的贮备液，然后用流动相按照梯度稀释至一系列浓度；然后将系列浓度的int3及int3异构体溶液、1.1中配置的各定位溶液分别按
1.2.3项下的检测条件进行检测，以浓度c(μg/ml)对峰面积(a)作图，结果如下表所示。
[0102]
表3-1 int3异构体线性结果
[0103][0104]
表3-2 int3线性结果
[0105][0106][0107]
由上表中的数据可知，int3异构体在1.2520-208.6667μg/ml的范围内线性良好，int3在1.2582-209.6998μg/ml的范围内线性良好，说明本发明提供的检测方法在一定范围内进样量和峰面积呈良好的线性关系。
[0108]
(4)回收率考察
[0109]
精密称取int3异构体约87.5mg，置50ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为int3异构体贮备液。精密量取int3异构体贮备液20ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率贮备液。精密量取回收率贮备液3ml置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率对照溶液。
[0110]
精密称取约75mg的int3，置50ml量瓶中，加入适量流动相超声溶解，精密加入回收率对照溶液1ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率低供试品溶液；精密称取30mg的int3，置20ml量瓶中，加入适量流动相超声溶解，精密加入回收率贮备液3ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率中供试品溶液；精密称取30mg的int3，置20ml量瓶中，加入适量流动相超声溶解，精密加入回收率贮备液4.5ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收率高供试品溶液；每个浓度平行配制3份，按照1.2.3项下的检测方法进行检测，测试结果如下表所示。
[0111]
表4 int3异构体回收率结果
[0112]
[0113][0114]
由上表中的数据可知，int3异构体的回收率在99％-110％之间，rsd为3.15％，说明本发明提供的检测方法回收率良好。
[0115]
(5)重复性考察
[0116]
按1.1中供试品溶液的配制方法平行配制6份供试品溶液，按照1.2.3中的检测条件测试int3异构体的含量，测试结果如下表所示。
[0117]
表5重复性结果
[0118][0119]
由上表中的数据可知，本发明提供的检测方法重复性良好。
[0120]
(6)稳定性考察
[0121]
按1.1中供试品溶液的配制方法配制供试品溶液，然后分别于0h、2h、3h、6h、8h、12h、15h，按照1.2.2项下的条件进行检测，测试结果如下表所示。
[0122]
表6溶液稳定性结果
[0123]
放置时间int3异构体峰面积int3峰面积int3异构体峰面积百分比(％)0h6317446379860490.101h6126616349049530.102h6230166393188500.103h6126316427752360.106h6144446498248530.098h6390236537600030.1012h6507916633425380.1015h6574086736378920.10平均峰面积6302156494437970.10rsd％2.792.093.58
[0124]
由上表中的数据可知，15h内供试品溶液中int3及int3异构体的峰面积稳定，表明本发明提供的检测方法稳定性良好。
[0125]
(7)耐用性考察
[0126]
精密称取1.1中配制的供试品溶液，分别改变1.2.3项下的流速、柱温、检测波长、流动相比例，其他检测条件不变进行检测，检测结果如下表所示。
[0127]
表7不同检测条件下的分离度结果
[0128][0129]
由上表中的数据可知，通过改变流动相比例、检测波长、柱温及流速等条件，分离度均符合要求，表明本发明提供的检测方法耐用性良好。
[0130]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。