一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.流行性感冒主要是由上呼吸道(鼻腔、咽喉、支气管)或极少数肺部的病毒感染引起的。通常情况下，感染持续时间大约一周。其临床体征表现主要有：突发高烧、肌肉酸痛、头痛、心神不宁、干咳、咽喉疼痛以及鼻炎。绝大多数患者不需要通过治疗就能在1-2周后自愈。在婴幼儿、老年人或那些患有癌症、糖尿病以及心血管、肺部疾病的易感人群中，感染会导致许多严重的并发症，如肺炎、甚至死亡。流感传播病毒主要为甲型流感病毒(influenza a，tfv a)和乙型流感病毒(influenza b，tfv b)；甲型流感病毒有4种亚型：h3n2，h1n1，h5n1和h7n9。
3.甲型流感病毒和乙型流感病毒感染的实验室诊断方法主要有三类:
①
以病毒培养为代表的细胞生物学方法；
②
以直接荧光抗体测定(dfa)法、酶免疫法(eia)和胶体金法为代表的免疫学方法；
③
以核酸探针检测法和核酸扩增技术(pcr,lcr)为代表的分子生物学检测方法。
4.病毒培养：病毒培养不仅可用于病毒鉴定，还可进一步用于抗原和基因特性、药物敏感性试验和疫苗制备。病毒分离是人流感确诊的金标准，但是病毒分离的实验条件要求较高，加之其有高致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。此外，为了避免病毒失活，需要将标本快速送至实验室，对送检时间和条件的要求较高。传统的培养方法费事，一般需要2～10天，常规流感诊断一般不使用此方法。
5.免疫学方法：免疫学方法包括检测上呼吸道样本中的特异性抗原和血清等体液样本中的抗体。直接荧光抗体测定(dfa)法可以检测各种类型的标本。这种技术敏感、特异、快速，是一种操作性和实用性都很强的诊断技木平。但此项技术操作要求高。且长时间观察荧光显微镜，容易引起视觉疲劳，不适于大规模的临床筛查。检测特异性抗体既可以检测总抗体，也可检测特异性igg、iga或igm抗体，但只能在发病2～3周后甚至更长时间才会有抗体出现，对于未曾患过流感的儿科患者价值较大。
6.聚合酶链反应技术：pcr(聚合酶链反应)是1985年建立起来的一种体外dna扩增试验。其基本原理是酶促dna合成反应，即在模板dna、引物和脱氧核糖核酸存在下，在dna聚合酶的作用下，使dna链扩增延伸。由于试验的敏感性和特异性高，对标本采集的要求远不如培养那么严格，使它在医学领域得到广泛应用。其缺点是对技术条件和实验室条件要求高。
7.腺病毒(adenovirus，adv)是一种中型大小的病毒，约90-100nm大，是一种无外套膜的二十面体双股dna病毒，有核衣壳。可感染人类的腺病毒(had)约有57种血清型，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染。人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病有关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。腺病毒的抵抗力、感染力很强，经常会引起家庭内感染、幼儿园、小学等的集体感染。在5岁以
下的婴幼儿中，5％左右的急性呼吸器官感染和10％婴幼儿肺炎认为是由腺病毒感染引起。
8.腺病毒感染的主要检测方法：组织病理学法、病毒分离培养法、抗原检测法、分子生物学法。
9.组织病理学：依据肺的组织病理学特征可对腺病毒(adv)引起的肺炎引起的肺炎加以鉴别，但临床上存在其他病因导致的相似组织病理学特征，从而对临床诊断做出误导，依然需要原位杂交、免疫组化和pcr等进行进一步病原学鉴定。
10.病毒分离培养法：绝大多数腺病毒都可以在人上皮细胞系上生长良好，细胞感染后会出现细胞圆缩和核内包涵体聚集成串等病变现象，其病变在2～7天可见，并可持续到28天。尽管细胞培养仍然是金标准，但对临床标本仍是不敏感，且比较慢，易受细菌和真菌的污染而不适用于临床快速检测。
11.抗原检测法：常用来直接检测adv在呼吸道的感染，较快速且灵敏度较高。常用免疫荧光、酶免疫分析、免疫层析和乳胶聚集法。
12.分子生物学法：分子生物学技术用来检测adv基因组，方法敏感，当患者体内病毒载量较低时更为适用。其缺点是对技术条件和实验室条件要求高。
13.呼吸道合胞病毒(rsv)是1岁以下婴幼儿呼吸道感染(包括毛细支气管炎和肺炎)最重要的病因之一。呼吸道合胞病毒的最初症状类似轻微的感冒症状，比如流鼻涕、轻微咳嗽、发烧等，甚至有时出现呼吸费力。重症下呼吸道疾病有可能在任何年龄段发生，特别是老年人或那些心血管、肺部和免疫系统病变人群中。呼吸道合胞病毒主要通过呼吸道侵入人体，并通过空气(尘埃，飞沫)传播，在环境中生存时间长达6h，当污染过的手或物品直接接触眼或鼻黏膜时，最易发生感染。
14.呼吸道合胞病毒的实验室诊断方法主要有三类：病毒分离培养法、免疫学方法、聚合酶链反应技术。
15.病毒分离培养：细胞培养仍然是金标准，但对临床标本仍是不敏感，且比较慢，大约在5～10天，易受细菌和真菌的污染而不适用于临床快速检测。
16.免疫学方法：实验室检测呼吸道合胞病毒(rsv)抗原的免疫学诊断方法包括补体结合试验、间接免疫荧光试验等，较快速且灵敏度较高，在临床上较为常见。
17.聚合酶链反应技术：由于试验的敏感性和特异性高，对标本采集的要求远不如培养那么严格，使它在医学领域得到广泛应用。其缺点是对技术条件和实验室条件要求高。
18.副流感病毒(parainfluenza virus，piv)存在于呼吸道分泌物中，通过人与人的直接接触和飞沫经呼吸道传播。对于成人，副流感病毒主要侵犯呼吸道黏膜的表层组织，在上皮细胞内增殖，引起的病变较轻，一般表现为上呼吸道感染。小于5岁的婴幼儿，病毒常侵犯气管、支气管黏膜上皮细胞，引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂。当侵犯肺泡上皮及间质细胞，则引起间质性肺炎或表现为急性阻塞性喉气管支气管炎和肺炎。根据遗传学和血清学可分为4型，hpiv1-4，其中hpiv4又分为hpiv4a和hpiv4b。每种亚型主要的结构和生物学特征相似，但流行病学和所引发疾病的临床特征又差异。hpiv1和hpiv2是婴幼儿急性喉、气管、支气管炎的主要病原；hpiv3是仅次于rsv的引起婴幼儿毛细支气管炎的病原；hpiv4在儿童和成人只引起轻度的上呼吸道感染，临床少见。值得一提的是，hpiv1及3亚型是引起呼吸道感染暴发流行的主要病原之一。
19.副流感病毒的实验室诊断方法主要有四类：呼吸道上皮细胞直接染色镜检法、病
毒分离培养法、免疫学方法、分子生物学法。
20.呼吸道上皮细胞直接染色镜检法：将采集到的呼吸道上皮细胞进行荧光染色，进行镜下观察，但此项技术操作要求高，且长时间观察荧光显微镜，容易引起视觉疲劳，不适于大规模的临床筛查。
21.病毒分离培养：细胞培养是金标准，但对临床标本仍是不敏感，且比较慢，大约在2～8天，易受细菌和真菌的污染而不适用于临床快速检测。
22.免疫学方法：通常是血清学试验，检查副流感病毒的抗体可以采用补体结合、血凝抑制、酶免疫法等。抗体检验不能辨别病毒型别。
23.分子生物学法：主要指pcr技术，主要步骤包括rna提取、引物和探针的设计以及pcr扩增技术，还可以进行血清学的分型。但是需要昂贵的仪器配套以及专业的技术人员，对其在临床上推行有较大的限制作用。
24.综上所述，甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒的现有检测方法大致相同。培养法具有高敏感性但耗时多，对实验室生物安全等级要求高；分子生物学技术虽然敏感度和特异性都俱佳，并且耗时短，但是需要昂贵的仪器配套以及专业的技术人员，对其在临床上推行有较大的限制作用。基于甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒感染上呼吸道的部位相同，症状相似，且常合并感染，有必要研究一种可完成多种病原体同时检测的试剂盒，以方便患者及临床检验人员，提高检测效率。


技术实现要素：

25.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，仅需一次取样及样本处理过程的条件下，同时完成甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的病原体检测，效率高，且特异性强，灵敏度高。
26.本发明的目的之二在于提供上述呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的制备方法。
27.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
28.一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，包括检测卡，所述检测卡包括分别用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的五个检测条，每个检测条均包括底板、吸水纸、加样垫、乳胶结合垫和硝酸纤维素膜，所述加样垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾连接并固定于所述底板上，每个乳胶结合垫分别固定有乳胶微球标记的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的特异性抗体，每个硝酸纤维素膜分别对应设有包被甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒抗体的检测线和包被羊抗鼠igg的质控线。
29.进一步地，所述乳胶微球为呈红色的聚苯乙烯微球，粒径为200-400nm。
30.进一步地，还包括样本提取液，所述样本提取液为磷酸盐缓冲液。
31.进一步地，其使用方法包括以下步骤：
32.s1，将取样拭子置于样本提取液中，搅拌后静置，移除取样拭子，得到样本液；
33.s2，将样本液滴加到检测卡的加样垫中，15-20min后观察并判断结果。
34.进一步地，其使用方法的步骤s1中，所述取样拭子为从鼻咽或口咽取样。
35.进一步地，其使用方法的步骤s2中，判断结果的具体步骤为：若样本液中含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，则在对应检测条的检测线位置上呈现相应的色条带；若待测样本中不含甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，则在对应的检测线上不显色；同时无论样本液中有无甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，各检测条的质控线都应呈现色条带，否则，检测无效。
36.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
37.一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
38.1)采用乳胶微球分别标记甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的特异性抗体，得到抗体-乳胶体复合物；将所述抗体-乳胶体复合物喷涂到吸附膜上，干燥，形成乳胶结合垫；
39.2)将甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒抗体分别包被在对应的硝酸纤维素膜上，形成检测线；将羊抗鼠igg分别包被在位于检测线另一侧的硝酸纤维素膜上，形成质控线；干燥，制得设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
40.3)在底板上分别顺次搭接对应的加样垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，组成对应的板后，切成对应的检测条；
41.4)将制得的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒检测条各一条进行组装，即得检测卡。
42.进一步地，步骤1)中，抗体-乳胶体复合物的喷涂量为0.1～5μl/cm。
43.进一步地，步骤2)中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒抗体的包被浓度分别为0.1～3mg/ml；
44.所述抗羊igg的包被浓度为1～2.5mg/ml。
45.进一步地，步骤1)中，干燥的温度为45-55℃，相对湿度≤20％，干燥时间为0.5-2h；
46.步骤2)中，干燥的温度为55-60℃，相对湿度≤20％，干燥时间为14-16h。
47.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
48.本技术的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，采用乳胶层析法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒进行联合检测，其中，采用彩色乳胶微球分别标记甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒的特异性抗体制备的乳胶结合垫，和分别包被有甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒的抗体(即检测线/t线)和羊抗鼠igg(即质控线/c线)的硝酸纤维素膜，得到的检测试剂盒仅需一次取样及样本处理过程的条件下，同时完成甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒的抗原检测，且效率高，特异性强，灵敏度高，可重复性强。本发明可快速对待测样本进行甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒的定性检测判断，效率高，特异性强，灵敏度高。
49.本发明的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的制备方法，可快速制备上述检测试剂盒，工艺简单，制备成本低。
附图说明
50.图1是本发明实施例1中检测卡的结构示意图。
51.图2是本发明的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的检测示意图。
52.图中：1、加样垫；2、乳胶结合垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水纸；5、底板。
具体实施方式
53.下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
54.实施例1
55.一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，如图1所示，包括检测卡，所述检测卡包括分别用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的五个检测条和设有五个对应显示窗和加样孔的卡板，每个检测条均包括加样垫1、乳胶结合垫2和硝酸纤维素膜3、吸水纸4和底板5，所述加样垫1、乳胶结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4依次首尾连接并固定于所述底板5上。
56.每个乳胶结合垫2分别固定有乳胶微球标记的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的特异性抗体，所述乳胶微球为呈红色的聚苯乙烯微球，粒径为200-400nm。
57.每个硝酸纤维素膜3分别对应设有包被甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒抗体的检测线(t线)和包被羊抗鼠igg的质控线(c线)。
58.进一步地，还包括样本提取液，所述样本提取液为磷酸盐缓冲液。
59.一种呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
60.1)采用乳胶微球分别标记甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的特异性抗体，得到对应的抗体-乳胶体复合物；将所述抗体-乳胶体复合物分别喷涂到吸附膜上，喷涂量为2μl/cm，干燥，形成乳胶结合垫；其中，干燥温度为50℃，相对湿度≤20％，干燥时间为1h；
61.2)将甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒抗体分别包被在对应的硝酸纤维素膜上，包被浓度为1mg/ml，形成检测线；将羊抗鼠igg分别包被在位于检测线另一侧的硝酸纤维素膜上，包被浓度为1.5mg/ml，形成质控线，干燥，制得设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；干燥的温度为57℃、相对湿度≤20％，干燥时间为15h。
62.3)在底板上分别顺次搭接对应的加样垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，组成对应的板后，切成对应的检测条；
63.4)将制得的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒检测条各一条与卡板进行组装，即得检测卡；
64.5)进行试剂盒组装时，除一定数量的用铝箔袋密封好的检测卡外，放入对应量的样本提取液及说明书，完成组装。
65.性能分析
66.本实施例通过对呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的检出限进行测试分析；
67.新型甲型流感病毒h1n1(2009)(a/california/08/2009)：最低检出限不高于
105tcid50/ml；
68.季节性甲型流感病毒h1n1(a/pr/8/34)：最低检出限不高于2
×
104tcid50/ml；
69.甲型流感病毒h3n2(a/hong kong/8/68)：最低检出限不高于4
×
103tcid50/ml；
70.甲型流感病毒h5n1(a/beijing/302/54)：最低检出限不高于5
×
103tcid50/ml。
71.乙型流感病毒(yamagata)：最低检出限不高于105tcid50/ml；
72.乙型流感病毒(victoria)：最低检出限不高于5
×
103tcid50/ml；
73.腺病毒3型(gb)：最低检出限不高于104tcid50/ml。
74.腺病毒7型(gomen)：最低检出限不高于102tcid50/ml。
75.呼吸道合胞病毒a型(long)：最低检出限不高于103tcid50/ml。
76.呼吸道合胞病毒b型(wv/14617/85)：最低检出限不高于103tcid50/ml。
77.副流感病毒1型(c35)：最低检出限不高于2
×
105tcid50/ml；
78.副流感病毒2型(greer)：最低检出限不高于5
×
103tcid50/ml；
79.副流感病毒3型(c243)：最低检出限不高于105tcid50/ml。
80.本实施例的检测试剂盒的检出限较低，且检测效率高，操作简单，特异性强，灵敏度高，检测结果可供临床参考。
81.实施例2
82.呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的使用方法，应用实施例1所述的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，包括以下步骤：
83.1)取样：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子；
84.2)将取样拭子滴加0.75ml样本提取液，转动拭子15次后静置2min，沿管壁挤压拭子后取出拭子弃之，得到样本液；
85.3)将样本液分别滴加到加样孔中，每孔滴入80ul，在15min后，20min内判读结果观察并判断结果。
86.如图2所示，判断结果：在甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒对应的检测条上检测线和质控线都应呈现红色条带，结果为：阳性。阳性结果表明：样本中含有甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒抗原。
87.实施例3
88.呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的使用方法，应用实施例1所述的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，包括以下步骤：
89.1)取样：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子；
90.2)将取样拭子滴加0.75ml样本提取液，转动拭子15次后静置2min，沿管壁挤压拭子后取出拭子弃之，得到样本液；
91.3)将样本液分别滴加到加样孔中，每孔滴入80ul，在15min后，20min内判读结果观察并判断结果。
92.如图2所示，判断结果：甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼吸道合胞病毒/副流感病毒对应的检测条上仅质控线(c线)出现一条红色条带，在检测线(t线)内无红色条带出现，结果为：阴性。阴性结果表明：样本中不含有甲型流感病毒/乙型流感病毒/腺病毒/呼
吸道合胞病毒/副流感病毒抗原，或是含量低于可检测范围。
93.实施例4
94.呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒的使用方法，应用实施例1所述的呼吸道感染病毒抗原联合检测试剂盒，包括以下步骤：
95.1)取样：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子；
96.2)将取样拭子滴加0.75ml样本提取液，转动拭子15次后静置2min，沿管壁挤压拭子后取出拭子弃之，得到样本液；
97.3)将样本液分别滴加到加样孔中，每孔滴入80ul，在15min后，20min内判读结果观察并判断结果。
98.如图2所示，判断结果：质控线(c线)未出现红色条带，结果为：检测无效；表明操作过程不正确或检测卡已变质损坏。有时因样本中抗原含量非常多，检测线(t)处条带很深而质控线(c)处无条带的情况，需将样本稀释后检测。
99.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。