禽流感(H5+H7)三价DNA疫苗的构建及其应用

禽流感(h5 h7)三价dna疫苗的构建及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明提供一种表达h5亚型禽流感2.3.4.4h分支病毒、h5亚型禽流感2.3.4.4b分支病毒、h7n9禽流感病毒的禽流感血凝素蛋白(ha)的重组表达载体，包含有效量的上述重组表达载体的dna疫苗，所述疫苗可以有效预防和/或治疗h5亚型 2.3.4.4h分支、2.3.4.4b分支、h7n9禽流感病毒的感染。


背景技术：

2.近年来，h5亚型和h7亚型高致病性禽流感病毒(avian influenza virus， hpaiv)给一些国家的家禽养殖业、甚至是整个国民经济都造成了巨大的损失。h5亚型和h7亚型ai的爆发同样对公共卫生安全构成了严重的威胁。
3.aiv变异频繁，病毒表面糖蛋白血凝素ha基因是病毒基因组中变异率最高的分子，也是决定其抗原性的最主要的分子，并且在自然宿主中不断的发生着抗原漂移和抗原转变的进化和变异。国家禽流感参考实验室于 2020～2021年上半年期间，在全国范围内进行了禽流感病毒的主动监测，从活禽市场和家禽养殖场分离到一系列h5和h7亚型禽流感病毒，其中病毒ha基因序列分析发现，h5亚型病毒主要分属于2.3.4.4h分支(原将其划分为2.3.4.4d分支)和2.3.4.4b分支，其中2.3.4.4h分支主要为h5n6 亚型禽流感病毒，分布于广东、广西、福建、山东、贵州、湖南、浙江、江苏、安徽、辽宁、吉林、江西、云南、四川和新疆等15个省份，2.3.4.4b 分支主要为h5n8亚型禽流感病毒，分布于江苏、浙江、河南、河北、广西、广东、湖南、江西、四川、山东、山西、陕西、北京和宁夏等14个省份(参见图11)；h7n9亚型禽流感病毒主要分布于河南、河北、山东、辽宁、内蒙古和云南等6个省份(参见图12)，给我国家禽养殖业和人类健康均构成威胁。
4.疫苗免疫是禽流感防控的关键措施之一，我国是国际上最早使用疫苗防治hpaiv的国家。dna疫苗(dna vaccine)又称基因疫苗(geneticvaccine)、核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，它是将编码目的抗原蛋白基因序列的质粒经肌肉注射导入宿主细胞，通过转录系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗，被称为“第三代疫苗”。dna疫苗与传统疫苗相比，具有十分显著的优势。dna疫苗能够同时诱导细胞免疫和体液免疫；不受母源抗体的影响，不会影响免疫检测；制备简单，对于变异频繁的病原，可以快速构建出抗原针对性的dna疫苗，也可以任意组成联合疫苗和多价疫苗，还具有环境友好和可靠的生物安全性等特点，是未来人和动物预防与治疗疫苗重要的技术发展方向之一。因此，dna疫苗被认为是防控流感的理想疫苗之一。
5.国家禽流感参考实验室研制的h5亚型禽流感dna疫苗(h5亚型， ph5-gd)于2018年获得了国家一类新兽药证书((2018)新兽药证字26 号)，这是我国获得批准的首个人和动物的dna疫苗产品。由于禽流感病毒在不断的进化和变异，禽流感dna疫苗(h5亚型，ph5-gd)不能对现有流行毒株提供完全有效的免疫保护，因此，需要不断地实时研制和更新针对新的变异毒株、抗原匹配性良好的新型dna疫苗。


技术实现要素：

6.本发明针对当前主要流行的h5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒、2.3.4.4b 分支禽流感病毒和h7n9禽流感病毒，通过系统的抗原性分析，筛选了 a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)(简称dk/fj/s1424/2020(h5n6)) 病毒作为2.3.4.4h h5分支的代表株、a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)(简称sw/sx/4-1/2020(h5n8))病毒作为2.3.4.4b h5分支的代表株、 a/chicken/yunnan/sd024/2021(h7n9)(简称ck/yn/sd024/2021(h7n9)) 作为h7n9禽流感病毒的代表株，分别将其血凝素基因(ha)进行测序、密码子优化、加入kozak序列优化后，替换dna载体pcaggoptiha5中的目的基因，分别构建了dna疫苗质粒ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx (h5-re14)和ph7-yn(h7-re4)，并随之对三种单价dna疫苗以及禽流感(h5 h7)三价dna疫苗(ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14) 株 ph7-yn(h7-re4)株)的免疫效力进行了评价。结果表明，三种单价 dna疫苗ph5-fj(re-13)、ph5-sx(re-14)和ph7-yn(h7-re4)以及禽流感(h5 h7)三价dna疫苗(ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14) 株 ph7-yn(h7-re4)株)均具有良好的免疫效力，能对当前流行的禽流感病毒的致死性攻击提供完全的免疫保护。禽流感(h5 h7)三价dna 疫苗(ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株 ph7-yn(h7-re4) 株)将为我国禽流感的防控提供必要的技术储备。
7.具体地，本发明提供了以下技术方案：
8.1、一种禽流感病毒血凝素蛋白，其具有如seq id no：1、seq id no：3 和/或seq id no：5所示的氨基酸序列。
9.2、编码如项目1所述的禽流感病毒血凝素蛋白的核苷酸序列。
10.3、根据项目2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有如seq id no：2、seq id no：4和/或seq id no：6所示的序列。
11.4、包含项目2或3所述的核苷酸序列的重组表达质粒。
12.5、根据项目4所述的重组表达质粒，其是将真核表达载体pcaggoptiha5经ecor i和xho i双酶切后，将如seq id no：2、seq idno：4和/或seq id no：6所示的核苷酸序列导入而得到的。
13.6、一种dna疫苗，其特征在于，其含有项目2或3所述的任意一种或多种核苷酸序列或项目4-5所述的任意一种或多种重组表达质粒，以及任选地药学上可接受的佐剂。
14.7、根据项目6所述的dna疫苗，其特征在于，其为适于以注射、粘膜、或基因枪导入的方式实施免疫的形式；
15.优选地，为适于以静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫的形式。
16.8、制备dna疫苗的方法，其包括将项目2或3所述的任意一种或多种核苷酸序列与真核表达载体(例如，pcaggoptiha5)可操作地连接的步骤。
17.9、项目2或3所述的核苷酸序列或项目4-5所述的重组表达质粒在制备用于预防禽流感病毒的dna疫苗中的用途。
18.10、根据项目8所述的用途，所述dna疫苗用于预防h5亚型和/或 h7n9亚型禽流感病毒。
19.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
20.(1)现有的禽流感dna疫苗(h5亚型，ph5-gd)不能对现有流行毒株提供有效的免疫
保护，本发明针对我国当前主要流行的h5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒、2.3.4.4b分支禽流感病毒和h7n9禽流感病毒，通过系统的抗原性分析，筛选了a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)(简称dk/fj/s1424/2020(h5n6))病毒作为2.3.4.4hh5分支禽流感病毒的代表株、a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)(简称sw/sx/4-1/2020(h5n8))病毒作为2.3.4.4bh5分支禽流感病毒的代表株、a/chicken/yunnan/sd024/2021(h7n9)(简称ck/yn/sd024/2021(h7n9))作为h7n9禽流感病毒的代表株；
21.(2)本发明对禽流感病毒的血凝素基因进行密码子优化，然后在此基础上加入kozak序列进一步优化，显著提高了抗原表达效率，同时所选用的真核表达载体为pcaggs，含有有利于高效表达的cmv增强子、鸡β-actin启动子及sv40polya信号调控元件，其表达效率优于常用的其它载体(例如载体pci)；
22.(3)本发明利用优化后的血凝素基因制备了表达所述三种不同的禽流感病毒血凝素(ha)蛋白的dna疫苗质粒，其不仅对同源ha基因供体毒株的攻击提供100％的免疫保护，还能分别对我国当前流行的h5亚型2.3.4.4h分支病毒、2.3.4.4b分支病毒和h7n9病毒的其他分离株的致死性攻击提供完全的免疫保护，所述三种dna疫苗质粒将为我国禽流感的防控提供必要的技术储备；
23.(4)本发明三种质粒等量混合制成的三价dna疫苗免疫后，不仅对三种同源ha基因供体毒株的攻击提供100％的免疫保护，还能对我国当前流行的h5亚型2.3.4.4h分支病毒、2.3.4.4b分支病毒和h7n9病毒的其他分离株的致死性攻击提供完全的免疫保护，所述三价dna疫苗将为我国禽流感的防控提供必要的技术储备。
附图说明
24.图1显示了基因opti-fjha5的pcr鉴定。其中，1.dl5000dnamarker；2.ph5-fj(h5-re13)；3.ddh2o对照；4.ph5-fj(h5-re13)/pcr产物。
25.图2显示了质粒ph5-fj(h5-re13)的酶切分析。其中，1.dl2000dnamarker；2.由bsai酶切的ph5-fj(h5-re13)；3.由ecori酶切的ph5-fj(h5-re13)；4.由pvuii酶切的ph5-fj(h5-re13)；5.ph5-fj(h5-re13)；6.dl15000dnamarker。
26.图3显示了基因opti-sxha5的pcr鉴定。其中，1.dl5000dnamarker；2.ph5-sx(h5-re14)质粒；3.ddh2o对照；4.ph5-sx(h5-re14)/pcr产物
27.图4显示了质粒ph5-sx(h5-re14)的酶切分析。其中，1.dl2000dnamarker；2.ph5-sx(h5-re14)/bsai；3.ph5-sx(h5-re14)/ecori；4.ph5-sx(h5-re14)/pvuii；5.ph5-sx(h5-re14)；6.dl15000dnamarker。
28.图5显示了基因opti-ynha7的pcr鉴定。其中，1.dl5000dnamarker；2.ph7-yn(h7-re4)；3.ddh2o对照；4.ph7-yn(h7-re4)/pcr产物。
29.图6显示了质粒ph7-yn(h7-re4)的酶切分析。其中，1.dl2000dnamarker；2.ph7-yn(h7-re4)/bsai；3.ph7-yn(h7-re4)/ecori；4.ph7-yn(h7-re4)/pvuii；5.ph7-yn(h7-re4)；6.dl5000dnamarker。
30.图7显示了质粒ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn(h7-re4)的表达。其中，a为转染质粒ph5-fj(h5-re13)48h的293t细胞，b为未转染质粒ph5-fj(h5-re13)的293t细胞(10*)；c为转染质粒ph5-sx(h5-re14)48h的293t细胞，d为未转染质粒ph5-sx
(h5-re14)的293t细胞(10*)；e为转染质粒ph7-yn(h7-re4)48h 的293t细胞，f为未转染质粒ph7-yn(h7-re4)的293t细胞(10*)。
31.图8显示了质粒ph5-fj(h5-re13)在293t细胞中蛋白表达产物的 western～blot分析；
32.图9显示了质粒ph5-sx(h5-re14)在293t细胞中蛋白表达产物的 western～blot分析；
33.图10显示了质粒ph7-yn(h7-re4)在293t细胞中蛋白表达产物的 western～blot分析。
34.图11显示了2020～2021年h5亚型禽流感病毒分离株ha基因进化分析。
35.图12显示了2020～2021年h7n9亚型禽流感病毒分离株ha基因进化分析。
36.图13显示了质粒pcaggoptiha5的图谱。
具体实施方式
37.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
38.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。本发明实施例中所使用的原料、试剂及其仪器的来源具体如下：
39.1、菌株、细胞与质粒
40.大肠杆菌jm109感受态细胞购自北京全式金生物公司；293t细胞(人胚胎肾细胞(crl-11268)，来自atcc)，质粒pcaggoptiha5为禽流感dna疫苗(h5亚型，ph5-gd)的有效成分，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存(其质粒图谱参见图13)。
41.2、酶及主要试剂
42.dna分子量marker；各种限制性内切酶，phusion高保真dna聚合酶以及t4 dna连接酶购自new england biolabs(neb)公司；dna胶回收试剂盒及小量质粒dna提取试剂盒购自于axygen公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒，质粒中量提取试剂盒购自qiagen公司；lipofectamine
tm 2000，青链霉素双抗购自invitrogen有限公司；dmen，opti-mem细胞培养液均购自gibco公司；氨苄霉素购自biosharp公司；引物合成由上海英潍捷基有限公司完成；基因测序试剂盒购自abi公司；本实验中所使用的其他试剂均为国产分析纯或者进口分装。
43.3、抗体
44.兔抗鸡igg-fitc荧光二抗购自sigma公司；兔抗gapdh多克隆抗体购自santa cruz biotechnology公司；山羊抗兔g00cw二抗、驴抗鸡800cw二抗购自li-cor公司。
45.4、病毒、抗原
46.攻毒用h5亚型和h7亚型hpaiv
47.a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)(简称dk/fj/s1424/2020(h5n6))、a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)(简称sw/sx/4-1/2020(h5n8))、a/chicken/yunnan/sd024/2021(h7n9)(简称ck/yn/sd024/2021(h7n9)) 株以及其标准抗原均获自中国农业科学院哈尔滨
兽医研究所国家禽流感参考实验室。
48.3株h5n6病毒a/goose/guizhou/s1569/2021(h5n6)(简称 gs/gz/s1569/2021(h5n6))、a/duck/guangxi/s10961/2021(h5n6) (简称dk/gx/s10961/2021(h5n6))和a/duck/hunan/s10322/2021(简称dk/hun/s10322/2021)作为2.3.4.4h(该分支原命名为2.3.4.4d)分支流行病毒代表毒株，2株h5n8病毒a/swan/beijing/1/2021(h5n8)(简称sw/bj/1/2021(h5n8))、a/duck/guangdong/s1269/2021(h5n8亚型)(简称dk/gd/s1269/2021(h5n8))和1株h5n6亚型 a/duck/sichuan/s1805/2021(h5n6)(简称dk/sc/s1805/2021(h5n6)) 作为2.3.4.4b分支流行病毒代表株，4株h7n9亚型2021年分离株 a/chicken/jilin/sd027/2021(h7n9)(简称ck/jl/sd027/2021)(h7n9) 和a/chicken/yunnan/sd016/2021(h7n9)(简称ck/yn/sd016/2021 (h7n9))a/chicken/hebei/sd015/2021(简称ck/heb/sd015/2021)株和a/chicken/shandong/sd005/2021(简称ck/sd/sd005/2021)株作为h7 亚型流行代表株，也均获自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室。
49.5、spf鸡胚和spf鸡
50.实验所有的9～11日龄spf鸡胚和3周龄spf鸡均由依托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的国家禽类实验动物资源库提供，免疫试验期间所有spf鸡均饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中，攻毒试验在生物安全三级实验室(bsl3)里进行。
51.6、主要仪器
52.小型离心机，梯度pcr仪为德国eppendorf公司产品；凝胶电泳成像仪，倒置荧光显微镜为德国蔡司公司产品；其余仪器均为国产。
53.实施例1、禽流感病毒ha基因的密码子优化与合成
54.将鸡使用的密码子和流感病毒使用的密码子做了比较分析，确定了鸡最偏嗜的密码子和流感病毒最偏嗜的密码子(见表1)，利用dnastar软件分别将流感病毒dk/fj/s1424/2020(h5n6)、sw/sx/4-1/2020(h5n8) 和ck/yn/sd024/2021(h7n9)的野生型ha基因(seq id no：7、8、9) 的密码子全部替换为鸡体最偏嗜的密码子，并在起始密码子atg前加入 kozak序列gccgccacc，从而书写出密码子优化的基因的序列(即，seq idno：2、seq id no：4、seq id no：6)，在优化后的基因两端分别添加ecor i和xho i限制酶酶切位点后，送由吉林省库美生物科技有限公司合成。
55.表1鸡和流感病毒最偏嗜的密码子
56.氨基酸鸡流感病毒精氨酸arg(r)cgcaga亮氨酸leu(l)cugcug丝氨酸ser(s)agcuca苏氨酸thr(t)accaca脯氨酸pro(p)ccccca丙氨酸ala(a)gccgca甘氨酸gly(g)ggcgga缬氨酸val(v)guggug赖氨酸lys(k)aagaaa谷氨酰胺gln(q)cagcaa
天冬酰胺asn(n)aacaau组氨酸his(h)caccau谷氨酸glu(e)gaggaa天冬氨酸asp(d)gacgau酪氨酸tyr(y)uacuau半胱氨酸cys(c)ugcugc苯丙氨酸phe(f)uucuuc异亮氨酸ile(i)au℃aua甲硫氨酸met(m)augaug色氨酸trp(w)uggugg
57.实施例2、表达优化ha基因的重组质粒构建与鉴定
58.使用限制性内切酶ecori和xhoi分别处理pcaggoptiha5质粒载体与合成的在pmd18t载体上的优化基因，16℃连接，分别获得ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)、ph7-yn(h7-re4)质粒载体，将所述质粒载体转化jm109大肠杆菌感受态，使用限制性内切酶ecori、bsai和pvuii对重组质粒进行酶切鉴定，同时用载体上的上游引物以及优化基因上的下游引物进行插入片段的pcr鉴定，所用的引物如下：
59.ph5-fj(h5-re13)株：
60.上游引物5’～ttcggcttctggcgtgtgac～3’(seqidno：10)，
61.下游引物5’～ccgctgatctcctcgcgcttc～3’(seqidno：11)；
62.ph5-sx(h5-re14)株：
63.上游引物5’～ttcggcttctggcgtgtgac～3’(seqidno：12)，
64.下游引物5’～ccagccgccctcgatgaagc～3’(seqidno：13)；
65.ph7-yn(h7-re4)株：
66.上游引物5’～ttcggcttctggcgtgtgac～3’(seqidno：14)，
67.下游引物5’～tgctgctctccacggtcacca～3’(seqidno：15)。
68.鉴定结果如下：
69.将质粒载体ph5-fj(h5-re13)用上述特异性的上下游引物进行pcr鉴定时，得到了长约1.7kb的条带，与预期结果一致(图1)。将质粒ph5-fj(h5-re13)用ecori酶切得到约6.5kb的片段，用pvuii酶切得到约6.5kb的片段，用bsai酶切得到约3.1kb、2.3kb和1.1kb的片段，所得结果均与预期大小一致(图2)，表明重组质粒构建成功。
70.将质粒载体ph5-sx(h5-re14)进行pcr鉴定时，得到了长约1.2kb的条带，与预期结果一致(图3)。将质粒ph5-sx(h5-re14)用ecori酶切得到约6.5kb的片段，用pvuii酶切得到约5.5kb和1kb的片段，用bsai酶切得到约3.5kb和3kb的片段，所得结果均与预期大小一致(图4)，表明重组质粒构建成功。
71.将质粒载体ph7-yn(h7-re4)进行pcr鉴定时，得到了长约770bp的条带，与预期结果一致(图5)。将质粒ph7-yn(h7-re4)用ecori酶切应得到约6.5kb的片段，用pvuii酶切应得到约6.3kb和200bp的片段，用bsai酶切应得到约3.8kb和2.7kb的片段，所得结果均与预期大小一致(图6)，表明重组质粒构建成功。
72.实施例3、重组质粒体外表达的间接免疫荧光鉴定
73.1、转染质粒的提取
74.将上述鉴定为阳性的3种质粒分别转化jm109感受态，涂于含氨苄抗性的固体lb平板，挑取阳性克隆，加入到100ml含100μg/ml氨苄霉素的液体lb培养基中，37℃200rpm培养16h并收获菌体，按照qiagen 质粒中量提取试剂盒提取。
75.2、重组质粒的瞬时转染
76.使用含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗的dmem培养基于co2(5％) 培养箱中培养293t细胞，待细胞密度达到80％时将细胞转接至多聚赖氨酸包被的六孔板中用于转染，转染按照lipofectamine tm 2000说明书进行，并设置未转染质粒的293t细胞作为阴性对照。
77.3、间接免疫荧光鉴定
78.转染之后12h换液；36小时收获细胞，弃掉培养液，pbst清洗3次细胞，每次5分钟；使用3％的对聚甲醛对细胞室温固定30min；pbst清洗细胞3次，每次5min；1％bsa室温封闭细胞30min；弃掉封闭液，5％bsa 稀释的h5亚型或h7亚型禽流感阳性血清(500倍稀释)作为一抗，37℃作用1h；pbst清洗3次细胞，每次5min；1％bsa稀释的兔抗鸡igg-fitc (300倍稀释)作为二抗，37℃避光作用1h；pbst清洗细胞3次，每次 5分钟；弃掉清洗液，用pbs清洗一次之后加入碱性甘油(ph＝9.8)，置于荧光显微镜下观察。
79.结果发现，质粒ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn (h7-re4)分别转染239t细胞后，经过间接免疫荧光染色，表达的特异的蛋白产物主要分布于细胞膜上，并在荧光显微镜下呈现出特殊的荧光。在转染后48h，质粒ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn (h7-re4)均可在293t细胞中高效表达(图7)。
80.实施例4、重组质粒体外表达的western-blot鉴定
81.1、重组质粒的瞬时转染
82.按照实施例3中所述的瞬时转染方法分别转染ph5-fj(h5-re13)、 ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn(h7-re4)。
83.2、细胞的裂解
84.转染后48h收获细胞，弃掉培养基，pbs洗两次，之后用pbs重悬两个孔的细胞并转移至2ml离心管内，1500g离心10min，加入70μl细胞裂解液，1μl核酸酶，在冰上裂解40min，每隔10min震荡混匀一次以加速裂解，待裂解液澄清时即可完成裂解。
85.3、重组蛋白的western blot鉴定
86.取20μl细胞裂解液，加入5μl 4
×
蛋白上样缓冲液，煮沸5min，之后使用12％sds-page蛋白凝胶进行电泳；电泳结束后使用湿转的方法进行转膜，转膜条件为电流350ma转膜80min；用5％脱脂乳封闭nc膜，4℃过夜；pbst洗3次；用h5亚型多克隆抗体(1∶300稀释)和兔抗gapdh 内参抗体(1∶5000稀释)作为一抗，37℃震荡孵育1h；用驴抗鸡800cw二抗和山羊抗兔800cw二抗，稀释倍数均为1∶5000， 37℃避光震荡孵育1h；pbst清洗3次，每次5min；取出nc膜，使用 odyssey红外激光成像系统进行扫描。
87.western-blot检测结果如下：
88.分别收集转染质粒48h的293t细胞，其中，将ph5-fj(h5-re13) 转染的细胞用h5亚型h5-re13株阳性血清进行western-blot分析，结果可检测出分子量约为72kda的ha蛋白、
46kda的ha1蛋白和26kda的 ha2蛋白(图8)；将ph5-sx(h5-re14)转染的细胞用对应的h5亚型h5-re14株阳性血清进行western-blot分析，结果可检测出分子量约为 74kda的ha蛋白、50kda的ha1蛋白和24kda的ha2蛋白(图9)；将ph7-yn(h7-re4)转染的细胞用h7亚型h7-re4株阳性血清进行 western-blot分析，结果可检测出分子量约为72kda的ha蛋白、46kda 的ha1蛋白和26kda的ha2蛋白(图10)。
89.实施例5、病毒鸡胚半数致死量eid
50
的测定
90.将病毒dk/fj/s1424/2020(h5n6)、sw/sx/4-1/2020(h5n8)、 ck/yn/sd024/2021(h7n9)、gs/gz/s1569/2021(h5n6)、dk/gx/s10961/2021(h5n6)、dk/hun/s10322/2021(h5n6)、sw/bj/1/2021 (h5n8)、dk/sc/s1805/2021(h5n6)、dk/gd/s1269/2021(h5n8)、 ck/jl/sd027/2021(h7n9)、ck/heb/sd015/2021(h7n9)、 ck/sd/sd005/2021(h7n9)和ck/yn/sd016/2021(h7n9)的尿囊液用无菌pbs进行10倍连续倍比稀释至10-10
，将其中10-5到10-10
六个稀释度接种9日龄鸡胚，每个稀释度做4个重复，37℃孵化48h；之后收取50μl 尿囊液进行血凝试验，根据reed-meunch法计算病毒的eid
50
，结果如表 2。
91.表2各病毒的eid
50
[0092][0093]
以上测定出了不同的禽流感病毒的eid
50
，为后期病毒攻击试验奠定了基础。
[0094]
实施例6、dna疫苗的制备和配制
[0095]
将质粒ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn(h7-re4) 分别转化jm109感受态细胞，均匀涂布于含氨苄抗性的固体lb平板上， 37℃培养过夜；将单个阳性菌落接种于5ml含氨苄的液体lb培养基中， 37℃震荡培养12h；之后接种于500ml含氨苄的液体lb培
养基中，37℃震荡培养16h；按照qiagen公司质粒大量提取试剂盒(maxi endofree) 说明书进行质粒的大量提取。
[0096]
三种单价dan质粒稀释后直接注射接种免疫，每种质粒的免疫剂量为30μg；或者，也可将3种质粒等浓度等量混合，配制成禽流感(h5 h7) 三价dna疫苗(ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株，ph7-yn (h7-re4)株)，其中每种质粒的免疫剂量均为30μg。
[0097]
实施例7、spf鸡免疫方法与免疫程序
[0098]
1、三种单价dna疫苗试验分组情况
[0099]
三种单价质粒的免疫剂量分别为30μg质粒，免疫后用同源以及异源病毒攻击评价其各自的免疫保护效力。ph5-fj(h5-re13)用4株2.3.4.4h 分支的h5n6病毒进行攻击；质粒ph5-sx(h5-re14)用4株2.3.4.4b分支的h5病毒攻击；质粒ph7-yn(h7-re4)用4株h7n9病毒攻击，具体分组情况见表3，表4和表5。
[0100]
表3质粒ph5-fj(h5-re13)的免疫分组
[0101][0102]
表4质粒ph5-sx(h5-re14)的免疫分组
[0103][0104][0105]
表5质粒ph7-yn(h7-re4)的免疫分组
[0106][0107]
单价dna疫苗免疫采用两点法肌肉注射，每个位点注射0.1ml疫苗，免疫总体积为0.2ml，每种质粒的免疫总剂量分别为30μg。
[0108]
免疫程序：所有实验组spf鸡在3周龄时进行首次免疫，首免3周之后按照相同的剂量进行一次加强免疫。
[0109]
2、三价dna疫苗试验分组情况
[0110]
按照下表对禽流感(h5 h7)三价dna疫苗(ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株 ph7-yn(h7-re4)株)进行同源以及异源攻毒保护实验(见表6)，以评价该疫苗对当前流行的不同禽流感代表毒株攻击的保护情况。
[0111]
表6三价dna疫苗实验分组情况
[0112]
[0113][0114]
三价dna疫苗免疫也采用两点法肌肉注射，每个位点注射0.1ml疫苗，免疫总体积为0.2ml，免疫总剂量为90μg。
[0115]
免疫程序：所有实验组spf鸡在3周龄时进行首次免疫，首免3周之后按照相同的剂量进行一次加强免疫。
[0116]
实施例8、hi抗体的测定
[0117]
hi抗体测定方法：将25μl血清加入到96孔v型血凝板中，用无菌 pbs做连续2倍倍比稀释至2-12
，其中阳性对照孔加入阳性血清，阴性对照孔加入pbs；之后加入25μl 4单位抗原(每组血清采用与攻毒毒株对应的抗原进行检测)，室温作用20min；加入25μl 1％红细胞悬液，室温静置20min，观察并记录最终结果。
[0118]
加强免疫后7天，每只鸡各采血分离血清，第sv1～第sv4组、第 tv1～第tv3组用禽流感h5亚型h5-re13株血凝抑制试验抗原测定hi 抗体效价，第sv5～第sv8组、第tv4～第tv6组用禽流感h5亚型 h5-re14株血凝抑制试验抗原测定hi抗体效价，第sv9～第sv12组、第 tv7～第tv9组用禽流感h7亚型h7-re4株血凝抑制试验抗原测定hi抗体效价。
[0119]
结果，dna疫苗ph5-fj(h5-re13)免疫后，第sv1～第sv4组的 hi抗体平均滴度分别为4log2、4log2、4log2、4.1log2；dna疫苗ph5-sx (h5-re14)免疫后，第sv5～第sv8组的hi抗体平均滴度为4.6log2、 4.2log2、4.2log2、4.3log2；dna疫苗ph7-yn(h7-re4)免疫后，第sv9～第sv12组的hi抗体平均滴度分别为4log2、4.1log2、4.2log2、4.2log2；对照组鸡hi抗体效价均为阴性＜1，结果详见表7。
[0120]
三价dna疫苗免疫后，第tv1～第tv3组的hi抗体平均滴度分别为4.1log2、4.1log2、4log2，第tv4～第tv6组的hi抗体平均滴度为4.3log2、 4.3log2、4.4log2，第tv7～第tv9组的hi抗体平均滴度分别为4.2log2、 4log2、4.2log2；对照组鸡hi抗体效价均为阴性＜1，结果详见表8。
[0121]
表7三种单价dna疫苗免疫后诱导的针对不同抗原的hi抗体滴度
[0122][0123][0124]
表8三价dna疫苗免疫后诱导的针对不同抗原的hi抗体滴度
[0125][0126]
以上结果表明了，三种单价dna疫苗分别免疫后均能诱导产生针对各自抗原的不低于4log2的hi抗体平均水平；三价dna疫苗免疫后能同时诱导产生针对三种抗原的不低于4log2的hi抗体平均水平，且三价dna 疫苗诱导产生的hi抗体平均水平跟三种单价dna疫苗分别诱导产生的 hi抗体平均水平相当。
[0127]
实施例9、攻毒保护实验
[0128]
每组实验鸡和对照鸡均在加免后1周攻毒，攻毒毒株如表2所示；攻毒之后的观察期为14天，观察期内每天观察和记录免疫组和对照组鸡的发病和死亡情况，并进行病毒分离与滴定：攻毒后第3天、第5天和第5 天，采集每只鸡喉头和泄殖腔拭子。经尿囊腔接种10日龄spf鸡胚5枚，孵育观察72小时，无论死胚、活胚，均测定ha效价每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有一枚鸡胚尿囊液ha效价≥1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性，表明该只鸡排毒。阴性样品用鸡胚盲传一代，病毒分离仍为阴性则表明该只鸡不排毒。
[0129]
三种单价dna疫苗的免疫结果发现，在14天观察期内，dna疫苗 ph5-fj(h5-re13)免疫后，4组对照鸡均在攻毒后3天内全部发病死亡，攻击4株h5亚型2.3.4.4h分支h5n6禽流感病毒的4组免疫组鸡均健活，且无发病，无排毒，无死亡；dna疫苗ph5-sx(h5-re14)免疫后，攻击4株h5亚型2.3.4.4b分支禽流感病毒的免疫鸡均健活，且无发病，无排毒，无死亡，
对应的4组对照鸡均在攻毒后3天内全部发病死亡；dna 疫苗ph7-yn(h7-re4)免疫后，攻击4株h7n9亚型禽流感病毒的4组免疫组鸡均健活，所有免疫鸡均无发病，无排毒，无死亡，对应的4组对照鸡均在攻毒后5天内全部发病死亡，详细见表9。
[0130]
表9三种单价dna疫苗免疫后对当前流行株的攻毒保护性试验
[0131][0132][0133]
注：*3天内死亡的鸡在第3天也采集拭子，一代阳性的无需盲传；/鸡只死亡。
[0134]
三价dna疫苗的免疫研究结果发现，三价dna疫苗免疫后，在攻击 3株h5亚型2.3.4.4h分支h5n6禽流感病毒、3株h5亚型2.3.4.4b分支禽流感病毒、3株h7n9禽流感病毒后14天观察期内，9组对照鸡均在攻毒后3～5天内全部发病死亡；所有免疫鸡均健活，均无发病，无排毒，无死亡。详细见表10。
[0135]
表10鸡接种禽流感(h5 h7)三价dna疫苗后对当前流行株的攻毒保护性试验
[0136][0137][0138]
注：*3天内死亡的鸡在第3天也采集拭子，一代阳性的无需盲传；/鸡只死亡。
[0139]
讨论
[0140]
禽流感病毒变异频繁，新的毒株和分支在不断出现和变化，必须实时进行监测和分析，及时研制针对流行毒株、抗原匹配的疫苗并更新，这样才能有效、科学地防控禽流感。dna疫苗制备简单、快速，生产不依赖于大量的鸡胚供应，且具有更广泛的交叉保护性，dna疫苗免疫不干扰流行病学的监测，dna疫苗的研制成为禽流感疫苗研究的重要课题。由于dna疫苗是溶解于pbs中透明清亮的水剂溶液。dna质粒很容易溶解，可以以较高浓度稳定保存，可以随意将任意几种dna质粒溶解混合而不影响不同质粒之间的特性，因此，dna疫苗更容易制成多价疫苗。
[0141]
全国禽流感流行病学调查结果显示，目前h5亚型病毒主要分属于 2.3.4.4h分支(原将其划分为2.3.4.4d分支)和2.3.4.4b分支，其中2.3.4.4h 分支主要为h5n6亚型禽流感病毒，2.3.4.4b分支主要为h5n8亚型禽流感病毒，为目前威胁我国养禽业的主要流行株；同时可监测到h7n9亚型禽流感病毒。
[0142]
本研究选择目前我国主要流行的2.3.4.4h h5分支的代表株 a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)(dk/fj/s1424/2020(h5n6))、2.3.4.4b h5分支的代表株a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)(sw/sx/4-1/2020 (h5n8))、h7n9禽流感病毒的代表株a/chicken/
yunnan/sd024/2021 (h7n9)(ck/yn/sd024/2021(h7n9))，分别将其血凝素基因(ha) 进行密码子优化的ha基因的密码子优化改写为鸡体所偏嗜的密码子，构建了dna疫苗ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx(h5-re14)和ph7-yn(h7-re4)，分别将其转染293t细胞进行体外表达验证，间接免疫荧光实验和westernblot结果表明，质粒可以与各自对应的阳性血清发生特异性反应，不同的 ha蛋白均可以在293t细胞中高效表达。
[0143]
免疫效力试验结果表明，禽流感dna疫苗ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx (h5-re14)、ph7-yn(h7-re4)以及禽流感(h5 h7)三价dna疫苗 (ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株 ph7-yn(h7-re4)株) 免疫后能诱导产生较高水平的hi抗体，且免疫鸡对不同分支代表分离株的攻击均能够提供100％的免疫保护，所有免疫鸡不发病、不排毒、无死亡。
[0144]
禽流感dna疫苗ph5-fj(h5-re13)免疫后对近期主要流行的h5n6 亚型2.3.4.4h分支病毒代表分离株的攻击能够提供良好的免疫保护效果，禽流感dna疫苗ph5-sx(h5-re14)免疫后对近期主要流行的h5亚型 2.3.4.4b分支病毒代表分离株的攻击能够提供良好的免疫保护效果，禽流感dna疫苗ph7-yn(h7-re4)免疫后对h7n9亚型代表分离株的攻击能够提供良好的免疫保护效果。禽流感(h5 h7)三价dna疫苗(ph5-fj (h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株，ph7-yn(h7-re4)株)免疫后，对近期主要流行的h5n6亚型2.3.4.4h分支病毒代表分离株、h5亚型 2.3.4.4b分支病毒代表分离株、h7n9亚型代表分离株的攻击能够同时提供良好的免疫保护效果，禽流感dna疫苗ph5-fj(h5-re13)、ph5-sx (h5-re14)、ph7-yn(h7-re4)以及禽流感(h5 h7)三价dna疫苗 (ph5-fj(h5-re13)株 ph5-sx(h5-re14)株，ph7-yn(h7-re4)株) 可以应用于当前禽流感的防控实践。
[0145]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0146]
序列表
[0147]
seq id no：1，dk/fj/s1424/2020(h5n6)的ha氨基酸序列
[0148][0149]
seq id no：2，dk/fj/s1424/2020(h5n6)的密码子优化后的ha基因序列
[0150][0151]
seq id no：3，sw/sx/4-1/2020(h5n8)的ha氨基酸序列
[0152][0153][0154]
seq id no：4，sw/sx/4-1/2020(h5n8)的密码子优化后的ha基因序列
[0155][0156]
seq id no：5，ck/yn/sd024/2021(h7n9)的ha氨基酸序列
[0157][0158][0159]
seq id no：6，ck/yn/sd024/2021(h7n9)的密码子优化后的ha基因序列
[0160][0161]
seq id no：7，dk/fj/s1424/2020(h5n6)的ha野生型基因序列
[0162]
[0163][0164]
seq id no：8，sw/sx/4-1/2020(h5n8)的ha野生型基因序列
[0165]
[0166][0167]
seqidno：9，ck/yn/sd024/2021(h7n9)的ha野生型基因序列
[0168][0169]
seqidno：10，ph5-fj(h5-re13)上游引物
[0170][0171]
seqidno：11，ph5-fj(h5-re13)下游引物
[0172][0173]
seqidno：12，ph5-sx(h5-re14)上游引物
[0174][0175]
seqidno：13，ph5-sx(h5-re14)下游引物
[0176][0177]
seqidno：14，ph7-yn(h7-re4)上游引物
[0178][0179]
seqidno：15，ph7-yn(h7-re4)下游引物
[0180]
。