一株杂色曲霉ZLH-1、蛋白酶及其制备方法和应用与流程

一株杂色曲霉zlh-1、蛋白酶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一株海洋来源的杂色曲霉zlh-1、蛋白酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.根据2018年《中国心血管病报告》，中国心血管疾病（cardiovascular diseases，cvds）患病人数的逐年上升，疾病死亡人数占因病死亡总人数的40.7％，高于肿瘤及其他疾病，占居民疾病死亡构成的 40% 以上。血液的非正常凝血造成血管阻塞形成的血栓性疾病是心血管疾病常见的一种类型，这类疾病因其具有高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率等的特点使大部分幸存者遗留不同程度的功能障碍，给患者、家庭乃至社会带来沉重的负担。寻求血栓治疗药物在临床治疗中具有重要的医学价值，其中在已形成的血栓性疾病中，能溶纤的蛋白酶具有巨大的应用前景。
3.近年来，临床上使用的一系列溶纤蛋白酶制剂多数是由陆栖原核微生物产生的，对于海洋源真核微生物的溶栓研究知之甚少。真菌作为真核微生物，具有完整的细胞器，而且海洋微生物因长期生活在海洋环境中，能够产生许多结构和功能与陆栖微生物不同的蛋白质类代谢物，是挖掘重要微生物代谢资源的宝库。


技术实现要素：

4.本发明以海洋真菌作为研究目标，从中国南海海域的海绵中分离到一株产活性蛋白酶的曲霉菌株zlh-1，经鉴定为杂色曲霉(aspergillus versicolor)，该曲霉菌可以产生一种高效溶解纤维蛋白的蛋白酶，其制备方法简便、快速，所产纤溶酶组分单一，活性强，并通过一系列的试验证明该蛋白酶能够高效溶栓，为治疗心血管疾病，尤其是血栓类疾病提供了有效的溶栓药物。
5.本发明提供了一株杂色曲霉zlh-1，其特征在于，所述杂色曲霉分类命名为杂色曲霉 aspergillus versicolor，于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.23230。
6.进一步的，本发明所述的杂色曲霉在pda琼脂培养基上正面菌体呈絮状，菌落不平，中央部分隆起；菌体颜色随生长时间变化，初为白色，后呈不同程度的黄绿色，边缘始终为白色。该杂色曲霉产生可溶性色素，扩散于基质中，初始为黄色，随着时间的增长，转变为红色。
7.本发明提供了一种含有如seq id no.1所示的氨基酸序列的蛋白酶。
8.进一步的，所述蛋白酶为m35家族的氘解素金属蛋白酶。
9.进一步的，所述m35家族的氘解素金属蛋白酶为纤溶酶。
10.进一步的，所述纤溶酶的分子量为37.28kda。
11.本发明提供的蛋白酶是由杂色曲菌zlh-1发酵而成的。
12.进一步的，所述纤溶酶的制备方法如下：
利用pda固体培养基活化杂色曲霉zlh-1，后将其接种至种子培养基中，获得种子液；将上述种子液按2%的质量比接种至麦芽汁液体培养基中发酵，获得发酵液，发酵上清液加入固体硫酸铵至饱和度90%，分离沉淀，获得粗酶；将上述粗酶经溶解、除盐和阴离子交换柱分离后获得纤溶酶。
13.具体的发酵产酶方法如下：（1）利用pda固体培养基在28-32℃下活化杂色曲霉zlh-1，后将其接种至种子培养基中，发酵条件为28-32℃、160-200 rpm培养20-26 h，即获得种子液。
14.（2）将步骤（1）种子液按2-5%的体积比接种至麦芽汁液体培养基中发酵，发酵条件为28-32℃、160-200rpm培养5-7 d获得发酵菌液。
15.（3）将所步骤（2）所得发酵菌液4℃、6000条件下离心后，去除沉淀，向上清液中加入终饱和度为20、30、40、50、60、70、80、90% 的硫酸铵，4℃过夜后10000离心15 min，保留沉淀，分别检测沉淀酶活，90%饱和度得到的沉淀具有最大酶活，即此时的沉淀为粗酶。
16.（4）将所述步骤（3）所得纤溶酶粗品脱盐后采用阴离子交换（uni
®
gel deae-80s-苯基）柱进一步分离纯化，通过sds-page法确定在nacl比例为30%~50%之间得到的组分是单一条带，经过酶活性检测确定为纤溶酶。
17.（5）将步骤（4）中sds-page凝胶上清晰的单一条带外送在上海派森诺生物科技有限公司使用shotgun技术对纤溶酶进行定性分析，在ncbi网站上进行比对，得到相应蛋白分子量(mw)为37.28kda，氨基酸序列seq id no.1。
[0018] 进一步的，制备过程中所述种子培养基的配方为新鲜马铃薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，麸皮5g，定容至1l。
[0019]
本发明提供了一种蛋白酶在降解酪蛋白中的用途。
[0020]
本发明提供了一种蛋白酶在降解纤维蛋白中的用途。
[0021]
进一步的，所述蛋白酶降解纤维蛋白，是优先降解纤维蛋白的γ链，后降解α，β链。
[0022]
进一步的，所述蛋白酶能够溶解血栓。该蛋白酶能够应用于制备治疗抗血栓产品中。
[0023]
本发明的有益效果：1.本发明提供了一株杂色曲霉zlh-1，通过一步纯化法即可得到蛋白酶。
[0024]
2.本发明提供了一种蛋白酶，能够高效降解酪蛋白。
[0025]
3.本发明提供了一种纤溶酶，该酶以100 μg/ml给药 24h后，小鼠尾部血栓溶栓率达86.67%，具有明显的体内溶栓效果，而临床药物溶栓酶给药尿激酶（10000u）给药24h后，溶栓率仅为52.76%，相比之下本发明所述蛋白酶的酶活是尿激酶（10000u）的1.6倍。
[0026]
4.本发明所提供了一种纤溶酶具有优秀的溶栓活性。本发明通过一系列的体外溶栓性质探究，初步证明了该酶具有较好的溶栓活性。借助构建动物血栓模型，表明其体内溶栓潜力，借助溶血试验，发掘其临床应用的安全性。另外，本发明所述的蛋白酶可以进行静脉给药，能迅速恢复栓塞组织的血供，改善栓塞组织的功能，为今后新型治疗血栓药物和保健品的开发提供科学证明及数据支撑。
[0027]
附图说明
[0028]
图1为杂色曲霉zlh-1的菌落形态特征及其色素变化。
[0029]
其中，a：pda培养基上的菌落形态，b：产生黄色色素时期，c：产生红色色素时期。
[0030]
图2为杂色曲霉zlh-1光学显微镜和扫描电镜的图片。
[0031]
其中，a：光学显微镜下的形态照片，b：扫描电镜图片（放大倍数5k
ꢀ×
）。
[0032]
图3为杂色曲霉zlh-1的系统发育树。
[0033]
图4 为杂色曲霉zlh-1 1-7d发酵液中蛋白酶在以酪蛋白平板上的酶活变化。
[0034]
图5为杂色曲霉zlh-1发酵液纯化的蛋白酶电泳图及降解酪蛋白能力验证。其中，a：粗酶及纯化蛋白酶在sds-page凝胶上的分子量，m：蛋白质marker，泳道1：90%硫酸铵沉淀，泳道2：阴离子交换柱纯化的蛋白酶;b和c：蛋白酶在酪蛋白平板上形成的透明圈及透明圈面积与蛋白酶浓度的关系，1-7分别对应浓度为10,20,30,40,50,60,70
ꢀµ
g/ml的蛋白酶溶液20
µ
l。
[0035]
图6 蛋白的三级结构模型。
[0036]
a.功能区模型。1.锌离子；2.mes；3.so4；4.gol；b.表面模型，根据静电表面电势的分布着色。蓝色表示带正电荷的区域，红色表示带负电荷的区域。
[0037]
图 7为纯化的蛋白酶具有溶解纤维蛋白的能力。
[0038]
a.纤溶酶在纤溶蛋白平板上降解纤维蛋白产生透明圈；b.纤溶酶降解纤维蛋白多肽链顺序的sds-page电泳图。
[0039]
图8 为不同浓度纤溶酶体外溶栓活性比较。
[0040]
其中，
ꢀ‑
：无菌生理盐水； ：尿激酶（10000 u）。
[0041]
图9 为不同浓度纤溶酶体外溶血性比较。
[0042]
其中，-：无菌生理盐水； ：尿激酶（10000 u）。
[0043]
图10 为不同浓度纤溶酶溶解小鼠尾静脉血栓（a）能力比较及其对应图片（b）。 其中，-：无菌生理盐水； ：尿激酶（10000 u）。
[0044]
具体实施方式
[0045]
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0046]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
[0047]
为了使本发明目的、技术方案及优点更明确，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048]
本文中所述的纤溶酶又称为纤维蛋白溶解酶。
[0049]
本发明中所需要的培养基的配方如下：（1）pda培养基（1l）：新鲜马铃薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，海水素15.0 g，琼脂20.0g，自然ph。
[0050]
（2）种子培养基（1l）：新鲜马铃薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，麸皮5g，自然ph。
[0051]
（3）麦芽汁培养基（1l）：17.0 g麦芽浸粉，3.0 g蛋白胨，15.0 g海水素，自然ph。
[0052]
（4）酪蛋白平板（1l）：干酪素（酪蛋白）5.0 g，硼酸缓冲液200 ml，1ml氢氧化钠溶液（0.5 m），琼脂20.0 g。
[0053]
（5）纤维蛋白平板（30 ml）: 100 mg 纤维蛋白原，300 mg琼脂, 15 ml的0.05 m tris-hcl （ph=7.2）溶液, 5 ml 0.025 m的cacl2溶液，10 ml 0.9 % nacl溶液，20 μl凝血酶（20 u/ml）。
[0054] 实施例1 杂色曲霉zlh-1的筛选一、平板纯化将采集的海绵样品用无菌水清洗3次，以去除表面附着物及其他杂质，样品剪切成 0.5 cm
3 左右的块状，放入含有1 ml 的无菌水的无菌研钵中研磨至无大块固体，即为母液。使用梯度稀释法对母液进行稀释，取10-1
、10-2
、10-3
梯度100 μl加上青霉素-链霉素溶液（青霉素10000u/ml，链霉素10 mg/ml）5 μl一起涂布到pda固体培养基上，28 ℃恒温培养 3 d，待长出真菌单菌落后，进一步分离纯化。
[0055]
二、平板筛选将单菌落依次接种到50 ml麦芽汁培养基中，28℃、180 rpm培养4 d。发酵上清液过0.22μm的滤膜后，取30 μl滴加到酪蛋白固体培养基上，并在37℃下静置12 h。筛选得到8株产蛋白酶的菌株，根据透明圈直径，选择其中较大的1株作为目标菌株，编号zlh-1。
[0056] 实施例2 杂色曲霉zlh-1的形态学和分子学鉴定一、菌株zlh-1的形态学鉴定杂色曲霉zlh-1在pda固体培养基上正面菌体呈絮状，菌落不平，中央部分隆起；菌体颜色随生长时间变化，初为白色，后呈不同程度的黄绿色，边缘始终为白色。杂色曲霉zlh-1能够产生可溶性色素，扩散于基质中，初始为黄色，随着时间的增长，转变为红色（图1）。菌株进行扫描电镜观察，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，呈辐射状半椭圆形，顶囊生有双层小梗，并产生孢子；产生的孢子较聚集，团聚成片，多为单细胞，呈卵圆形、球形，表面有小刺（图2）。
[0057]
二、菌株zlh-1的18s rrna扩增和序列测定取 0.2 ml 10%（w/v）的 chelex-100 溶液加入到无菌的离心管中，再从平板上挑取绿豆大小的菌丝体置于chelex-100 溶液中，在旋涡混合器上振荡 4-5 s 至菌株与溶液混合，然后沸水浴10 min；冷却至室温之后, 10 000 rpm离心10 min。 取上清液作为 pcr 扩增的模板进行rdna-its 扩增，通用引物为：its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。pcr反应体系为：模板1 μl；上下游引物各1 μl；2
×ꢀ
pcr master mix 12 .5 μl；ddh2o 9.5 μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃ 退火90 s，72℃延伸1 min，重复32个循环；72℃延伸10 min。pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶在tae缓冲液中100v电泳30 min，最后用紫外凝胶成像仪观察条带。
[0058]
将所得的pcr产物送上海派森诺生物科技有限公司进行测序，所得序列利用 ncbi中blast在线比对服务进行同源性比较分析，利用系统发育树软件mega 10 .0构建菌株zlh-1的系统发育树。结合菌株zlh-1的形态学特性（图1、2）和its同源构建发育树结果（图3），鉴定菌株zlh-1为杂色曲霉aspergillus versicolor。
[0059]
将筛选到的菌株进行菌种保藏，所述杂色曲霉zlh-1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年09月13日；保藏编号：cgmccno.23230。
[0060] 实施例3杂色曲霉zlh-1发酵制备蛋白酶种子液：利用固体pda培养基对杂色曲霉zlh-1进行活化：从斜面上切取一块放置在平板中央，28℃恒温避光培养3d。250ml三角瓶中装50ml种子培养基，其中加入一块边长为1cm左右的单菌落菌块，28℃、180rpm培养28h，即为种子液。
[0061]
发酵液：250ml三角瓶中装50ml麦芽汁培养基，按2%接入种子液，28℃、180rpm培养。
[0062]
从第1d开始每天取样1ml，在4℃、10000rpm条件下离心5min，取上清进行酶活检测，共监测7d，后续选择酶活最高的时间点为发酵结束时间，结果如图4所示，第6d达到峰值，即可停止发酵。
[0063]
酶活检测方法：取过0.22
µ
m滤膜的发酵液30
µ
l加到在蛋白平板上，37℃静置12h，根据透明圈直径大小确定酶活（图4）。
[0064] 实施例4蛋白酶的分离纯化粗酶：将发酵液在4℃、6000rpm条件下离心，上清液置于4℃磁力搅拌器上，少量多次加入粉末状硫酸铵至饱和度90%，在4℃条件下静止12h；90%硫酸铵饱和发酵液10000条件下离心15min，沉淀使用超纯水复溶后，使用分子截留量为1kda的超滤管脱盐并浓缩，即得到粗酶水溶液。
[0065]
采用阴离子交换（uni
®
geldeae-80s-苯基）柱对粗酶进一步纯化，上样量1ml粗酶液，流速1ml/min，流动相a为1mnacl(20mmtris，ph7.5)溶液，流动相b为20mmtris，ph7.5溶液，然后按照100min流动相a由0-100%进行梯度洗脱，每分钟收集1管；检测波长280nm。分离结果采用分离胶浓度为12%的sds-page凝胶进行检测，发现在nacl比例36-50%之间可以得到单一条带的酶（图5）。
[0066] 实施例5蛋白酶降解酪蛋白能力的验证按照酪蛋白平板的制备方式制备平板，并确保每个平板中准确含有20ml酪蛋白溶液，液体凝固后使用打孔器打孔，每孔分别加入浓度为10、20、30、0、50、60、70
µ
g/ml的蛋白酶溶液20
µ
l，37℃温育12h后拍照，并使用imagej软件分析透明圈面积。结果表明蛋白酶能够快速降解酪蛋白，并且浓度越高降解效果越好（图5）。
[0067]
实施例6蛋白酶氨基酸序列的测定提取杂色曲霉zlh-1总rna，由生工生物工程(上海)股份有限公司对其进行转录组测序。同时，将获得的纯酶10
µ
l加样到12%的sds-page凝胶上，90v电压跑胶，条带由浓缩胶跑至分离缩胶后改到110v至全程结束。使用干净的刀切割条带，干冰保存寄送上海派森诺生物科技有限公司，进行shotgun测序，得到目标蛋白的氨基酸部分序列，然后与获得的转录组序列进行比对，得到蛋白酶的全部氨基酸序列seqidno.1（图6）。
[0068]
实施例7蛋白酶三级结构预测氨基酸序列seqidno.1包括353个氨基酸，确定其为来自m35家族的氘解素金属蛋白酶。然后，通过同源性建模软件swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)选择来自鲑气单胞菌的2.0
å
锌金属内肽酶（smtlid:2x3a.1）作为蛋白质3d结构的模型。整个蛋
白质结构的模型包括2xzn
2
：（锌离子，非共价），2xmes（2-（n-吗啉基）-乙磺酸，非共价），6xso
42-（硫酸根离子，非功能性粘合剂），4xgol（甘油，非功能性粘合剂）（图6）。
[0069] 实施例8蛋白酶降解纤维蛋白并且测定多肽链顺序根据实施例1可知，蛋白酶具有降解酪蛋白的能力，本实施例改用纤维蛋白平板考察其作为纤溶酶的潜力。20
µ
l纯酶加到纤维蛋白平板上，37℃下孵育6h，发现有明显的透明圈产生，即蛋白酶可以降解纤维蛋白，也是纤溶酶。接下来，20
µ
l1%纤维蛋白原加入2
µ
l凝血酶（25u）混匀后在37℃下孵育30min，使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，一共准备9管。1管加入10
µ
l生理盐水为空白对照组，其他8管加入10
µ
l的纯酶（13.82
µ
g/ml），37℃孵育，分别在15min、30min、1h、2h、3h、5h、7h、9h各取出1管，加5.5
µ
lloadingbuffer(5
×
)，100℃沸水浴7min待用。由sds-page凝胶检测纤维蛋白随时间降解的情况，结果表明该酶首先降解纤溶蛋白的γ链并且在1h后就降解完全，其次是α与β链，2h后α链也完全降解，最后β链3h后也被降解，并且随着时间的延长，其降解产生的小分子蛋白也会被二次降解（图7）。由上述结果可知，实施例4获得的蛋白酶为纤溶酶，可以降解纤维蛋白。
[0070] 实施例9纤溶酶体外溶解血栓能力分析健康icr小鼠co2窒息死亡，迅速取心脏血0.5ml至1.5ml无菌离心管中，编号并称量空管质量（m1），室温下自然凝血。血块使用无菌生理盐水轻轻洗涤，每次1ml，洗涤3～5次直至上清液无红色为止。最后一次使用移液器吸走所有液体，并使用无菌滤纸吸走多余液体，并称量剩余血块及离心管质量(m2)。将洗涤过的血块设置为5组，每组三管，组1加入无菌生理盐水作为阴性对照，组2加入尿激酶(10000u)作为阳性对照，组3至组5分别加入30、60、100μg纯化的纤溶酶，37℃孵育3h后，微型离心机简短离心取出上清，并称取剩余血块质量及空管质量(m3)，最后血块溶解率按公式（1）计算。
[0071]
血块溶解率%=[m2-m3/m2-m1]
×
100
……………
（1）不同浓度的纤溶酶溶解血块的能力都高于尿激酶组（10000u）的46%，其中低浓度的纤溶酶组（30μg）与血块反应3h后，67%的血块就已经溶解，高浓度组的血块则几乎全部溶解，仅余不到10%。因此，该纤溶酶具有良好的体外溶栓功效（图8）。
[0072] 实施例10纤溶酶溶血情况根据《中国药典》(2015年版)制备2%红细胞悬液：取健康icr小鼠心脏血，用玻璃棒搅动血液，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入约10倍量的无菌生理盐水，混匀后1000rpm离心10min，除去上清液，沉淀的红细胞再用无菌生理盐水按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止，最后一次离心15min，轻柔移走上清液获得压积红细胞，0.2ml的压积红细胞稀释至10ml混匀即可获得2%红细胞悬液。
[0073]
按照2%红细胞悬液和实验试剂（60、120、200μg/ml的纯酶溶液）1:1的比例混匀，使用无菌生理盐水和0.2%的tritonx-100作为阴阳对照组，37℃温育3h，各取上清液150μl加到96孔板中，使用酶标仪545nm下测量吸光度，并按照公式（2）计算溶血率。
[0074]
溶血率%=[实验组-阴性组/阳性组-阴性组]
×
100%
……………
（2）所有剂量的纤溶酶的溶血率都低于5%（图9），符合注射给药的标准，总之，纤溶酶具有良好的血清稳定性，适合通过注射的方式治疗血栓疾病。
[0075] 实施例11小鼠尾静脉血栓溶解试验使用无菌生理盐水配置4种不同化学结构的卡拉胶(k-型卡拉胶、k-型卡拉胶寡
糖、卡拉胶寡糖、卡拉胶)溶液，分别进行icr小鼠尾静脉造模实验。结果表明k型卡拉胶造模成功率最高。具体造模方法如下：使用固定器固定小鼠，然后把固定器置于静脉可视仪上，棉绳在小鼠尾部远尾端7 cm处结扎，然后按照15 mg/kg尾静脉注射k-型卡拉胶，注射后的鼠尾放置在10℃水中保持10 min后解除结扎，自用活动，4 h后尾部呈现深红色则说明造模成功，并记录血栓长度（l1）。
[0076]
将15只雄性小鼠分成5组，每组3只。组1为阴性对照组，注射无菌生理盐水。组2为阳性对照组注射尿激酶(10000 u)，组3，4，5为实验组，分别注射30、60、100 μg纯化的纤溶酶（无菌生理盐水溶解），24 h后测量血栓长度(l2)并拍照。
[0077]
生理盐水不具备溶解血栓的能力，尿激酶(10000 u)在给药24 h后血栓平均长度由初始的2.90 cm减少到1.37 cm，溶解率为52.76%。纤溶酶给药30 μg时，血栓平均长度由3.03 cm减少到1.73 cm，溶解率为42.90%，溶栓效果低于尿激酶(10000 u)组。但是当给药量增加到60和100 μg时，溶栓效果明显提高，血栓平均长度分别减少了约2.54 cm和2.6 cm，溶解率则分别为80.13%和86.67%（图10）。根据上述溶栓结果可知，纤溶酶的溶栓效果表现为浓度依赖型，即浓度越高，溶栓效果越好。
[0078]
本发明获得的纤溶酶具有良好的体外溶解纤维蛋白的能力，并且优先降解γ链，然后是α和β链。体外实验也表明对动物血块有良好的溶解作用，并且体外溶血率也低于5%，达到了注射给药的标准。血栓模型动物注射不同剂量纯化纤溶酶24h后，各组尾部血栓长度均有变短，而且减少的长度与剂量呈正相关。
[0079]
以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。