一株防治西瓜根结线虫病的粘质沙雷氏菌及其应用

1.本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一株防治西瓜根结线虫病的粘质沙雷氏菌及其应用。


背景技术：

2.南方根结线虫(meloidogyne incongnita)是一类严重影响农业生产的植物寄生线虫，可危害多种作物。在西瓜保护地种植中南方根结线虫病常见发生，发病植株地上部分常表现为萎蔫或矮化，地下根肿大畸形或呈瘤状根结，导致营养物质吸收运输受阻。根结线虫在侵染过程中常与土壤病原真菌发生联合侵染，严重影响西瓜产量和品质。由于复种指数高，缺乏抗性品种等原因，西瓜根结线虫病防治目前主要以化学药剂为主。随着绿色无公害生产以及农业可持续发展战略的倡导，生物防治因环境兼容性强、不易产生抗药性等优点，在植物病害防控领域应用前景广阔。筛选具有根结线虫防控功能的生防细菌资源，对于开发新型生物农药产品、减少或者逐步替代化学农药进行西瓜等作物根结线虫病害绿色防控具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何防治西瓜根结线虫病并促进西瓜种子发芽。为解决以上技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌。
4.第一方面，本发明要求保护一种粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)。
5.本发明要求保护的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)其菌株号为jzbs6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.22675。
6.粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6在牛肉膏蛋白胨培养基上生长48h菌落表面光滑湿润、边缘整齐，玫红色、产色素(图1)。菌体短杆状，周生鞭毛、具有运动性，革兰氏染色为阴性。粘质沙雷氏菌jzbs6能够利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、山梨醇等，不能利用乳糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、尿素；能够产生过氧化氢酶，明胶液化阳性，不产生硫化氢，硝酸盐还原阴性(表1)。粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6具有seq id no.1所示的16s rdna序列，seq id no.2所示的gyrb序列。
7.第二方面，本发明要求保护前文第一方面所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的培养物。
8.所述培养物是将前文第一方面中所述的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6在细菌培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。
9.上述培养物中，所述物质包括粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6(菌体自身)和粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物。
10.术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核
苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。
11.上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。
12.术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。
13.在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为牛肉膏蛋白胨培养基。
14.第三方面，本发明要求保护一种菌剂。
15.本发明要求保护的菌剂含有前文第一方面中所述的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6、所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或前文第二方面中所述的培养物。
16.进一步地，所述菌剂可为根结线虫抑制剂、防控植物根结线虫病害的菌剂、促进植物种子发芽的菌剂、促进植物胚轴伸长的菌剂、促进植物胚根伸长的菌剂和/或提高植物种子活力指数的菌剂。
17.上述菌剂中，所述菌剂的活性成分可为所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6、所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的培养物，所述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分。所述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对根结线虫抑制效果、对植物根结线虫病害防控效果、对植物种子发芽的促进效果、对植物胚轴/胚根伸长的促进效果、对植物种子活力指数的提高效果来确定。
18.上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
19.上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
20.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
21.上述菌剂中，所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物可从所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的培养物中获得(如无菌发酵滤液)。
22.第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6和/或所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或
前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：
23.a1)抑制根结线虫；
24.a2)制备根结线虫抑制剂；
25.a3)防控植物根结线虫病害；
26.a4)制备用于防控植物根结线虫病害的产品(如微生物农药)；
27.a5)促进植物种子发芽；
28.a6)制备用于促进植物种子发芽的产品(如微生物肥料)；
29.a7)促进植物胚轴伸长；
30.a8)制备用于促进植物胚轴伸长的产品(如微生物肥料)；
31.a9)促进植物胚根伸长；
32.a10)制备用于促进植物胚根伸长的产品(如微生物肥料)；
33.a11)提高植物种子活力指数；
34.a12)制备用于提高植物种子活力指数的产品(如微生物肥料)。
35.第五方面，本发明要求保护一种防控植物根结线虫病害的方法。
36.本发明要求保护的防控植物根结线虫病害的方法，可包括如下步骤：对植物根部施用前文第一方面中所述的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6和/或所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的菌剂。
37.在所述方法中，所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6和/或所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或所述培养物和/或所述菌剂通过灌根处理的方式施用到所述植物的根部。
38.进一步地，在进行所述灌根处理时，用于灌根的菌液中所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的浓度为2
×
107cfu/ml。进行所述灌根处理的次数可为一次或两次。
39.第六方面，本发明要求保护一种促进植物种子发芽和/或促进植物胚轴伸长和/或促进植物胚根伸长和/或提高植物种子活力指数的方法。
40.本发明要求保护的促进植物种子发芽和/或促进植物胚轴伸长和/或促进植物胚根伸长和/或提高植物种子活力指数的方法，可包括如下步骤：采用前文第一方面中所述的粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6和/或所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6的代谢物和/或前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的菌剂处理植物种子。
41.进一步地，所述处理植物种子可为浸泡所述植物的种子。
42.更进一步地，浸泡所述植物种子时采用所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的培养物或代谢物或无菌发酵滤液原液或其100-500倍稀释液。浸泡所述植物种子可为26-30℃(如28℃)浸泡24h。
43.其中，所述无菌发酵滤液原液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基后，于28℃、200rpm条件下培养48h，然后将获得的所述粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的培养物8000rpm离心10min，收集上清采用0.22μm的水系滤膜过滤即得。
incongnita)，记载于“文才艺等.黑曲霉y-61代谢活性物质对南方根结线虫的作用.江苏农业科学,2010,(6):157-159.”一文。
65.实施例1、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6菌株的分离与鉴定
66.一、菌株分离
67.粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6从北京市大兴区西瓜种植基地健康西瓜植株根际土壤中分离获得。采集健康西瓜植株完整根系，抖落掉附带的大块土壤后依然紧贴根系表面的土壤为根际土壤。用灭菌毛刷收集西瓜根际土壤，称取土样5g放入45ml无菌水中作为土壤悬液原液(10-1
浓度)。采用无菌移液管吸取1ml土壤悬液原液(10-1
浓度)于一管9ml无菌水中，摇匀即为10-2
浓度土壤悬液。同样方法依次稀释到10-6
浓度。采用稀释平板法将10-4
、10-5
和10-6
浓度的土壤悬液分别涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，倒置于28℃培养箱中培养48h。挑选合适稀释梯度的培养基平板，根据菌落形态、颜色、质地等挑取代表性细菌。获得的细菌通过稀释平板法挑取单菌落获得纯培养，纯培养菌株采用20％甘油管在-80℃冰箱中保存。取编号为jzbs6的菌株进行下述鉴定。
68.二、菌株鉴定
69.1、菌株形态观察
70.菌株jzbs6接种于牛肉膏蛋白胨培养基上28℃恒温培养48h，观察菌落形态、色泽、边缘、培养基颜色。从图1可以看到，菌株jzbs6在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落表面光滑湿润、边缘整齐、玫红色、产色素。镜检发现菌体短杆状，周生鞭毛、具有运动性，革兰氏染色为阴性，通过上述形态特征将菌株jzbs6初步鉴定为沙雷氏菌属(serratia sp.)。
71.2、生理生化特性检测
72.通过糖类发酵试验、明胶液化、产硫化氢、硝酸盐还原反应等测定菌株jzbs6各项生理生化指标。从表1可以看到，菌株jzbs6能够利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、山梨醇等，不能利用乳糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、尿素。菌株jzbs6能够产生过氧化氢酶，明胶液化阳性，不产生硫化氢，硝酸盐还原阴性。
73.表1、沙雷氏菌jzbs6生理生化特性检测结果
74.[0075][0076]
注：“ ”为阳性，
“‑”
为阴性。
[0077]
3、菌株分子生物学鉴定
[0078]
将菌株jzbs6接种到牛肉膏蛋白胨培养基上28℃培养48h。采用细菌dna提取试剂盒提取菌株jzbs6基因组dna，具体操作参考试剂盒说明书。采用细菌通用引物27f：5
’‑
aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3’和1492r：5
’‑
tac ggc tac ctt gtt acg act t-3’，以菌株jzbs6基因组dna作为模板扩增其16s rdna序列。50μl的pcr反应体系中含有双向引物各1.0μl，ddh2o 21.0μl，2
×
taq green mix dna聚合酶25.0μl，模板dna 2.0μl。pcr反应程序为94℃预变性2min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。采用引物对up-1s：5
’‑
gaa gtc atc atg acc gtt ctg ca-3’和up-2sr：5
’‑
agc agg gta cgg atg tgc gag cc-3’，以菌株jzbs6基因组dna作为模板扩增其gyrb序列。50μl的pcr反应体系中含有双向引物各1.0μl，ddh2o 21.0μl，2
×
taq dna聚合酶25.0μl，模板dna 2.0μl。pcr反应程序为95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸10min。pcr产物采用1％琼脂糖凝胶检测，回收产物经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送北京博迈德生物技术公司测序。菌株jzbs6具有序列表中seq id no.1的16s rdna序列和seq id no.2的gyrb序列。
[0079]
将所得16s rdna序列采用blast方法在ncbi中进行同源性比较，发现与菌株jzbs6同源性较高的菌株均属于沙雷氏菌属(serratia sp.)。选取该菌株以及与其相似性较高的菌株，使用mega5.0软件中neighbor-joining方法分别构建基于16s rdna和基于gyrb序列的系统进化树(图2和图3)。结果表明，基于16s rdna序列进化树中，沙雷氏菌jzbs6与粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)和嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodiphila)均聚在同一分支上。基于gyrb序列进化树中，菌株jzbs6与粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)sh118聚在同一分支上。
[0080]
因此，结合形态学特征、生理生化特性以及分子生物学方法将菌株jzbs6鉴定为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)。
[0081]
粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6已于2021年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.22675。下文简称粘质沙雷氏菌jzbs6或菌株jzbs6。
[0082]
实施例2、粘质沙雷氏菌jzbs6杀线虫活性
[0083]
(1)粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液制备
[0084]
将粘质沙雷氏菌jzbs6接种至牛肉膏蛋白胨平板，挑取单菌落接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、200rpm条件下培养48h。将获得的培养物8000rpm离心10min，收集上清采用0.22μm的水系滤膜过滤获得用于杀线虫活性检测的无菌发酵滤液。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000ml，混匀分装，121℃灭菌20min。
[0085]
(2)南方根结线虫卵囊及二龄幼虫获得
[0086]
南方根结线虫用番茄品种佳粉15号室内盆栽接种方式保存。在番茄根系有大量卵囊出现时将根系冲洗干净，小心取下卵囊用0.3％次氯酸钠溶液处理3min，无菌水冲洗3次后放在盛有少量无菌水的培养皿内，作为卵囊悬液4℃保存备用。取部分卵囊25℃培养4d，每隔24h收集一次新孵化的二龄幼虫，放在盛有少量无菌水的培养皿内，作为南方根结线虫二龄幼虫悬液室温保存备用。
[0087]
(3)粘质沙雷氏菌jzbs6对南方根结线虫二龄幼虫抑制活性检测
[0088]
采用24孔板法检测粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液对南方根结线虫二龄幼虫的抑制活性。将上面制备的菌株jzbs6无菌发酵滤液按照每孔100μl的量加入24孔板孔穴内，同时加入等体积(100μl)南方根结线虫二龄幼虫溶液(200条/ml)，每个处理重复3次。采用牛肉膏蛋白胨液体培养基无菌滤液替代菌株jzbs6无菌发酵滤液，与二龄幼虫溶液共培养作为对照。28℃培养24h后在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数，通过刺激法即在解剖镜下用毛针刺触虫体观察线虫是否活动，或线虫体型的变化判断线虫的死活，死的线虫多呈僵直状态，活的线虫弯曲或扭动。根据以下公式计算校正死亡率：
[0089]
线虫死亡率(％)＝死亡线虫数/供试线虫数
×
100
[0090]
校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)
×
100
[0091]
结果表明，粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液处理，南方根结线虫二龄幼虫死亡率为91.7％，校正死亡率为91.1％。具体参见表2和图4。
[0092]
表2、粘质沙雷氏菌jzbs6对南方根结线虫二龄幼虫毒杀活性
[0093][0094]
实施例3、粘质沙雷氏菌jzbs6对西瓜根结线虫病害防控效果评价
[0095]
将粘质沙雷氏菌jzbs6接种至牛肉膏蛋白胨平板，挑取单菌落接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的500ml三角瓶中，在28℃、200rpm条件下培养48h收集培养物，采用血球计数板调整菌株jzbs6培养物细胞数为2
×
107cfu/ml待用。
[0096]
在温室育苗盘中进行西瓜常规化播种育苗，选用西瓜品种为京美10k。西瓜长至两叶一心期移栽至装有无线虫田园土和营养土按照2:1比例混合的盆中。待西瓜长至4-5片真叶期，采用上述制备好的菌株jzbs6培养物(2
×
107cfu/ml)按照100ml每盆进行灌根处理。24h后采用根际打孔法接种南方根结线虫，即在植株根周围均匀取孔，将培养好的南方根结线虫制备成1000条/ml的二龄幼虫悬液滴入小孔中，每营养钵接种2ml，即2000条南方根结线虫。实验设3次重复，每个重复处理10盆。接种根结线虫7天后选择其中5盆采用粘质沙雷氏菌jzbs6培养物(2
×
107cfu/ml)再处理一次(用法用量同上)，正常田间管理。因此本实施例中，粘质沙雷氏菌jzbs6灌根包括两组处理，一组是仅在接种根结线虫前24h进行一次灌根处理，另一组是接种根结线虫前24h灌根处理并且在接种根结线虫7天后二次灌根处理。未接种培养基无菌滤液代替菌株jzbs6培养物灌根处理作为对照。接种线虫45天后将西瓜植株连根挖出注意保证根系完整，按照下面分级标准调查所有处理西瓜植株根结发生情况，计算根结线虫病情指数和防效。
[0097]
根结线虫病情指数分级标准：0级，无根结；1级，根结占整个根系1％-15％；2级，根结占整个根系16-25％；3级，根结占整个根系26-50％；4级，根结占整个根系51-75％；5级，根结占整个根系76-100％。
[0098]
根结线虫病情指数(％)＝[σ(各级病株数
×
各级代表值)]/(调查总株数
×
最高级代表值)
×
100。
[0099]
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％。
[0100]
结果表明，粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6液体发酵培养物在没有任何助剂添加的条件下一次灌根处理对西瓜根结线虫病防效达54.4％，二次灌根处理防效达60.2％(表3)。
[0101]
表3、粘质沙雷氏菌jzbs6培养物灌根处理对西瓜根结线虫病害防治效果
[0102][0103]
实施例4、粘质沙雷氏菌jzbs6对西瓜种子发芽的影响
[0104]
(1)粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液制备
[0105]
将粘质沙雷氏菌jzbs6接种至牛肉膏蛋白胨平板，挑取单菌落接种于装有100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、200rpm条件下培养48h。将获得的培养物8000rpm离心10min，收集上清采用0.22μm的水系滤膜过滤获得用于杀线虫活性检测的无菌发酵滤液。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000ml，混匀分装，121℃灭菌20min。
[0106]
(2)粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液对西瓜种子发芽的影响
[0107]
选取颗粒饱满、大小一致的西瓜种子(京美10k)，采用菌株jzbs6培养物的无菌发酵滤液原液(0)、100、200和500倍稀释液浸泡种子，未接种液体培养基无菌滤液作为对照。每个处理设3次重复，每个重复包括10粒种子。28℃放置24h后收集种子，无菌水冲洗干净，将其放在铺有两层无菌水浸湿滤纸的培养皿中，28℃继续保湿培养7d，统计西瓜发芽率，测量胚轴、胚根长度，计算种子活力指数：种子活力指数＝(胚轴长度 胚根长度)
×
发芽率。
[0108]
结果表明，菌株jzbs6无菌发酵滤液在适宜的稀释倍数下对种子发芽具有不同程度促进作用。菌株jzbs6无菌发酵滤液100倍稀释液处理，西瓜胚轴、胚根长度分别较对照增加9.6％、15.9％，种子活力指数增加18.3％；其200倍稀释液处理的西瓜种子，胚轴、胚根长度和活力指数较对照分别增加14.6％、11.0％和26.9％(表4)。菌株jzbs6无菌发酵滤液原液(0)处理，种子胚轴、胚根伸长以及种子活力指数受到抑制，可能与其代谢物中活性物质对西瓜种子发芽的影响存在高浓度抑制、低浓度促进的作用有关。
[0109]
表4、粘质沙雷氏菌jzbs6无菌发酵滤液对西瓜种子发芽的影响
[0110][0111]
以上试验结果表明，粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)jzbs6是一株具有应用价值的细菌，特别是对南方根结线虫的毒杀活性、对西瓜根结线虫病的防控效果以及对西瓜种子发芽的促进作用，显示出其良好的应用开发前景。
[0112]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。