KDM6B的多肽序列及对间充质干细胞功能的调控应用

kdm6b的多肽序列及对间充质干细胞功能的调控应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，特别涉及kdm6b的多肽序列及对间充质干细胞功能的调控应用。


背景技术：

2.随着人类寿命的延长和老龄化社会的到来，人口老龄化已经成为当今各国面临的日趋严重的社会问题。衰老作为生命过程中的一种生理现象，引起的神经退行性疾病，骨质疏松症，牙齿缺失，心血管疾病，肿瘤和代谢性疾病等都已经成为人类健康的重要威胁。人体的骨骼逐渐退化，骨质疏松症的患病率呈显著升高趋势。骨质疏松不仅累及椎骨、髋骨、指骨，也累及颌骨。全身骨骼系统的骨质疏松愈严重，其颌骨的骨及矿化组织丢失也愈明显。颌骨重建失衡、剩余牙槽骨吸收、颌骨萎缩，都会加速牙齿的松动脱落，严重影响颌骨保持面容、辅助发音以及咀嚼等重要功能。因此，老年人群中增龄性骨质疏松及牙齿缺失的防治将面临着巨大的挑战。目前针对于老年性疾病，增龄性骨质疏松及牙齿缺失的修复与治疗都存在不足。因此研究间充质干细胞在衰老条件下的分化和再生功能的调控机制，对老年性患者骨组织和牙齿组织的修复与治疗以及提高老年患者生活质量具有重要意义。
3.目前骨质疏松症的治疗方法主要是预防骨折，临床中最常使用的药物是双磷酸盐。尽管双磷酸盐可减少40％-70％的骨折发生，但同时也存在许多副作用，包括引起急性肾功能衰竭、食管癌，肌肉骨骼疼痛。此外，长期使用双磷酸盐会增加患者骨折的风险，尤其是典型股骨骨折和颌骨骨坏死。其他药物是利用合成代谢药物，刺激骨形成，降低患者骨折风险。甲状旁腺激素(pth)是美国食品和药物管理局批准的唯一刺激骨形成的药物，但它与骨肉瘤发病有关，只能使用2年。绝经后女性被认为是骨质加速流失的危险群体[29]，激素替代治疗(雌激素和黄体酮治疗、单独雌激素治疗或选择性雌激素受体调节剂)仍然是临床治疗的一线选择。然而，激素治疗会增加患者乳腺癌的患病风险。钙和维生素d的摄入仅适用于骨质疏松症的预防，它不能完全有效地避免骨质疏松的发展。现阶段虽然骨质疏松症治疗药物已有很多，但副作用明显，骨质恢复能力有限，且不同患者之间存在差异，单纯给与药物治疗，临床效果还有一定的提升空间。因此，了解骨质疏松症的病因和分子机制，有助于寻找更有效的治疗方法，可以防止骨组织微结构的恶化，维持骨的稳态。
[0004]
牙齿组织缺损、牙缺失是老年人群的常见病、多发病，严重影响患者的咀嚼、言语、美观和心理健康，现有的牙缺失修复方法属于非生物性的赝复体修复，价格高昂，常需损伤邻近健康牙齿，和天然牙存在较大差距。因此，牙齿组织再生已成为国际口腔医学研究的热点。间充质干细胞具有组织损伤修复及多向分化的能力，可分化成为中胚层的所有种类细胞，因此干细胞介导的组织工程技术已成为对多种组织损伤修复的重要手段。但干细胞和其他体细胞一样，损伤修复，更新及分化的功能会随着细胞衰老而递减,甚至出现功能失调，从而影响了干细胞的治疗效果。将老年患者自身间充质干细胞功能从衰老状态中恢复，将会增强衰老组织自身的修复再生潜能，并避免了异体间充质干细胞的免疫排斥反应。因此，阐明衰老间充质干细胞定向分化机制是组织修复再生的关键，对老年人骨组织和牙齿
组织的修复与治疗具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明研究了kdm6b、wdr5和mll1的关系，以及它们在间充质干细胞中衰老和成骨/牙分化的调控中的作用和机制。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]
本发明提供了蛋白复合体作为靶标在制备抑制间充质干细胞衰老、促进间充质干细胞成骨向分化或成牙向分化的试剂或药物中的应用；
[0008]
所述蛋白复合体包括第一蛋白复合体和第二蛋白复合体；
[0009]
所述第一蛋白复合体包括wdr5和kdm6b；
[0010]
所述第二蛋白复合体包括kdm6b、wdr5和mll1。
[0011]
最为重要的是，本发明还提供了生物活性肽，其具有：
[0012]
(i)、如seq id no.1或2所示的氨基酸序列；或
[0013]
(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
[0014]
(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
[0015]
本发明还提供了编码上述生物活性肽的核酸。
[0016]
此外，本发明还提供了能够表达上述生物活性肽的生物材料，所述生物材料包括表达载体、质粒、表达盒、重组菌或宿主细胞中的一种或多种。
[0017]
基于上述研究，本发明还提供了所述生物活性肽在制备抑制间充质干细胞衰老、促进骨髓间充质干细胞成骨向分化和/或促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化的试剂或药物中的应用。
[0018]
本发明还提供了所述生物活性多肽在制备骨质疏松、牙周炎防治和/或黏膜及皮肤缺损修复的试剂或药物中的应用。
[0019]
此外，本发明还提供了试剂或药物，包括所述生物活性肽以及药学上可接受的辅料。
[0020]
本研究从临床转化应用出发，在前期研究的基础上，阐明在特定临床条件下如何调控kdm6b/wdr5作用来逆转干细胞衰老，促进干细胞骨/牙向分化及骨/牙组织修复和再生。本研究也有助于阐明衰老及骨质疏松微环境中mscs功能调控的分子机制，为mscs的功能改建，促进组织再生提供靶基因和理论依据。通过本研究研发新的小分子制剂，作为衰老及衰老相关疾病的治疗药物达到促进骨/牙组织再生，为其临床转化应用提供依据。通过对kdm6b、wdr5、mll1信号分子对间充质干细胞衰老、分化功能的调控作用及分子机制的研究，发现：
[0021]
wdr5是负调控组蛋白去甲基化酶kdm6b和mll1功能的共结合蛋白。wdr5可以与组蛋白去甲基化酶kdm6b形成蛋白复合体，抑制kdm6b的功能最终达到调节干细胞衰老和分化功能及骨/牙组织修复再生功能的作用。在机制研究的基础上，我们针对kdm6b与wdr5结合区域序列，研发及利用小分子多肽，通过调控kdm6b/wdr5复合体的结合来调节间充质干细胞的功能。最终达到在衰老和骨质疏松条件下恢复间充质干细胞功能，从而促进骨/牙组织的修复再生。
[0022]
包括但不限于：
[0023]
(一)、对骨髓间充质干细胞的作用：
[0024]
1.在骨髓间充质干细胞中wdr5和kdm6b形成蛋白复合体。
[0025]
2.衰老骨髓间充质干细胞中wdr5和kdm6b蛋白复合体形成增多。
[0026]
3.生物活性多肽102、114抑制骨髓间充质干细胞衰老，促进骨髓间充质干细胞成骨向分化功能。
[0027]
4.生物活性多肽102、114抑制衰老小鼠骨髓间充质干细胞衰老，促进衰老小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化功能。
[0028]
(二)、对根尖牙乳头干细胞的作用：
[0029]
1.根尖牙乳头干细胞中kdm6b、wdr5、mll1形成蛋白复合体。
[0030]
2.突变kdm6b/wdr5蛋白结合位点，增强kdm6b抑制根尖牙乳头干细胞衰老，促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化功能。
[0031]
3.生物活性多肽102、114抑制根尖牙乳头干细胞衰老，促进根尖牙乳头干细胞成牙分化功能。
[0032]
(三)在骨质疏松防治中的应用。
[0033]
生物活性多肽114具有增强骨质疏松小鼠骨密度的作用，可有效预防骨质疏松小鼠骨质流失。
[0034]
(四)在牙周炎治疗中的应用。
[0035]
1.生物活性多肽114具有减轻小型猪牙周炎模型中牙周袋深度、附着丧失、牙龈退缩的功能。
[0036]
2.生物活性多肽114具有促进小型猪牙周炎模型中牙槽骨新骨形成的作用。
[0037]
3.生物活性多肽114具有促进小型猪牙周炎模型中牙龈软组织修复的作用。
附图说明
[0038]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0039]
图1示骨髓间充质干细胞中，wdr5与kdm6b、mll1形成蛋白复合体；在骨髓间充质干细胞中敲除wdr5后，co-ip结果显示wdr5敲除组中wdr5和kdm6b、mll1蛋白复合体形成减少，β-actin作为内参；
[0040]
图2示衰老条件下，骨髓间充质干细胞中wdr5与kdm6b、mll1结合增多；在2月龄c57bl/6小鼠和18月龄c57bl/6小鼠骨髓间充质干细胞中进行co-ip实验检测kdm6b、wdr5、mll1三者结合情况。co-ip结果显示，和年轻小鼠对比，衰老小鼠骨髓间充质干细胞中wdr5和kdm6b、mll1蛋白复合体形成增多，β-actin作为内参；
[0041]
图3示应用多肽微阵列技术发现kdm6b-wdr5蛋白结合位点；其中，a：以kdm6b制作多肽微阵列芯片与wdr5孵育，发现7个阳性多肽结合位点；b：kdm6b对应阵列的阳性膜上点光密度数值；c：co-ip结果检测发现，peptide 102、peptide114、peptide 152三条生物活性多肽中，只有102、114可以有效打开kdm6b/wdr5蛋白复合体的结合；
[0042]
图4示生物活性多肽102、114抑制骨髓间充质干细胞衰老，促进骨髓间充质干细胞成骨向分化；其中，a：端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，peptide114促进
骨髓间充质干细胞中端粒酶逆转录酶表达；b-c：β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致骨髓间充质干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少；d：和对照组相比，peptide102和peptide114促进骨髓间充质干细胞的alp活性；e-f：茜素红染色和钙离子定量分析结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组骨髓间充质干细胞矿化能力显著升高；*p≤0.05，**p≤0.01；
[0043]
图5示生物活性多肽102、114抑制衰老骨髓间充质干细胞衰老，促进衰老骨髓间充质干细胞成骨向分化；其中，a：β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致衰老骨髓间充质干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少；b：和对照组相比，peptide102和peptide114促进衰老骨髓间充质干细胞的alp活性；c-d：茜素红染色和钙离子定量分析结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组衰老骨髓间充质干细胞矿化能力显著升高；*p≤0.05，**p≤0.01；
[0044]
图6示根尖牙乳头干细胞中，kdm6b与wdr5形成蛋白复合体；其中，a：在根尖牙乳头干细胞中敲除kdm6b后，co-ip结果显示kdm6b敲除组中kdm6b和wdr5蛋白复合体形成减少，组蛋白h3作为内参；b：在根尖牙乳头干细胞中敲除wdr5后，co-ip结果显示wdr5敲除组中wdr5和kdm6b蛋白复合体形成减少，β-actin作为内参；
[0045]
图7示突变kdm6b序列102、114位点抑制根尖牙乳头干细胞衰老，促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化；其中，a：co-ip结果显示，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114组根尖牙乳头干细胞中kdm6b和wdr5结合减少；b：端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，ha-kdm6b-mut114促进根尖牙乳头干细胞中端粒酶逆转录酶表达；c-d：β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114组导致根尖牙乳头干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少；e：和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114组促进根尖牙乳头干细胞的alp活性；f-g：茜素红染色和钙离子定量分析结果显示，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114组根尖牙乳头干细胞矿化能力显著升高；*p≤0.05，**p≤0.01；
[0046]
图8示生物活性多肽102、114抑制根尖牙乳头干细胞衰老，促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化；其中，a：co-ip结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组根尖牙乳头干细胞中kdm6b和wdr5结合减少；b：端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，peptide114促进根尖牙乳头干细胞中端粒酶逆转录酶表达；c-d：β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致根尖牙乳头干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少；e：和对照组相比，peptide102和peptide114促进根尖牙乳头干细胞的alp活性；f-g：茜素红染色和钙离子定量分析结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组根尖牙乳头干细胞矿化能力显著升高；*p≤0.05，**p≤0.01；
[0047]
图9示注射生物活性多肽12周，重建cbct三维影像，测量新骨形成体积结果示114peptide组牙周炎缺损区新骨形成量高于control peptide组和pbs组；各组新骨形成量之间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0048]
图10示注射生物活性多肽12周，通过牙周探针测量发现，114peptide组牙周探诊深度明显低于pbs组及control peptide组；114peptide与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0049]
图11示注射生物活性多肽12周，通过牙周探针测量发现，114peptide组附着丧失
情况明显低于pbs组及control peptide组；114peptide组与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0050]
图12示注射生物活性多肽12周，通过牙周探针测量发现，114peptide组牙龈退缩程度明显低于pbs组及control peptide组；114peptide组与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0051]
图13示受检小型猪平卧于cbct扫描机床上，取自然咬位，头部固定，连续扫描获取cbct断层图像并使用mimics17.0图像处理软件对dicom图像三维重建。在建模前、建模后及术后分别获取cbct数据用于治疗后评估；术后三维重建模型显示pbs组/control peptide组/114peptide均有新骨形成；114peptide组新骨形成效果优于control peptide组和pbs组；
[0052]
图14示注射生物活性多肽12周，小型猪牙周组织骨缺损区pbs组/control peptide组/114peptide组伤口均有愈合，未见感染及坏死组织；114peptide组软组织修复效果优于control peptide组和pbs空白对照组；
[0053]
图15示生物活性多肽114促进小鼠腭部粘膜缺损愈合；对小鼠腭部粘膜缺损周围进行等量pbs、control peptide、114peptide注射，观察小鼠粘膜愈合变化情况；a,b,c代表小鼠腭部缺损愈合模型；d,e,f分别为14天时pbs组，control peptide组，114peptide组腭部粘膜缺损情况；g,h,i分别为21天时pbs组，control peptide组，114peptide组腭部粘膜缺损情况；结果显示，114peptide组与pbs组和control peptide组相比，腭部粘膜缺损有明显愈合；
[0054]
图16示pbs组、control peptide组和114peptide组在第14天和第21天时小鼠腭部粘膜缺损未愈合面积，114peptide组与pbs组、control peptide组相比有统计学意义；*p≤0.05；
[0055]
图17示，114peptide促进小鼠背部皮肤缺损愈合；对小鼠背部直径6mm全层皮肤缺损周围进行等量pbs、control peptide、114peptide注射，a,b分别为pbs组0天和14天小鼠皮肤缺损；c,d分别为control peptide组0天和14天小鼠皮肤缺损；e,f分别为114peptide组0天和14天小鼠皮肤缺损；114peptide组与注射pbs组和control peptide组相比，皮肤缺损有明显愈合；
[0056]
图18示通过计算pbs组、control peptide组和114peptide组在第10和14天时小鼠背部皮肤缺损愈合率，发现114peptide组与pbs组、control peptide组相比有统计学意义；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001；
[0057]
图19示生物活性多肽114预防骨质疏松小鼠股股骨质流失；a：对小鼠股骨干垢端进行micro-ct，观察小鼠骨小梁变化情况；b:通过对小鼠股骨干垢端micro-ct分析，发现注射pbs和control peptide组的小鼠，股骨骨小梁骨密度和ovx组小鼠没有明显差异；ovx组，pbs组，control peptide组和sham组进行对比，骨小梁骨密度出现明显下降；114peptide组小鼠骨小梁骨密度和ovx组，pbs组，control peptide组相比，明显上调。
具体实施方式
[0058]
本发明公开了kdm6b的多肽序列及对间充质干细胞功能的调控应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改
动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0059]
kdm6b作为h3k27me2/3的去甲基化酶，可以通过影响间充质干细胞特异性谱系分化，在骨组织和牙齿组织的发生过程中发挥重要作用。kdm6b也参与破骨过程，研究显示骨损伤后，破骨细胞分化增多可导致骨质疏松，在这一过程中，kdm6b降低了nfatc1基因上h3k27me3甲基化水平，激活了nfatc1基因表达达到对骨量的维持，限制骨质疏松的发生。此外，下调组蛋白去甲基化酶kdm6b表达可以导致细胞凋亡和衰老细胞增加，这种衰老过程导致了成年干细胞自我更新能力的丧失。由此我们猜想，kdm6b在间充质干细胞衰老和功能失调过程中发挥重要的功能作用。在本研究中，我们研究了kdm6b对间充质干细胞衰老的影响。实验结果表明，kdm6b可以抑制骨髓间充质干细胞和根尖牙乳头干细胞的β-gal和p16
ink4a
的表达并上调端粒酶逆转录酶活性。衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,sa-β-gal)活性是在培养细胞和新鲜组织样本中鉴定衰老细胞的最早生物标记之一，该标记有效证明了衰老细胞会在多种哺乳动物的衰老相关疾病病灶和衰老组织中逐渐积累。衰老细胞的另一个显著特征是细胞周期抑制蛋白的表达增加，这会导致衰老细胞的停滞状态的维持，进而导致衰老细胞的不断积累，其中p16
ink4a
是最主要的细胞周期抑制蛋白。目前，槲皮素和非瑟酮已被证实可在体外和体内的各种情况下刺激组织和细胞对抗衰老。最明显的结果是两者可以有效的降低p16和sa-β-gal表达。除此之外，在衰老和端粒功能障碍的背景下，抑制端粒缩短作为预防和减少细胞衰老的措施被认为是一种可靠的治疗方法。tert的全身递送减少了一些衰老标记和与衰老相关的条件，并延长了野生型小鼠的寿命，因此证明端粒功能的维持在自然衰老中起作用。
[0060]
结合文献以及前期实验数据提示，kdm6b具有促进间充质干细胞成骨/成牙定向分化及抑制间充质干细胞衰老的功能。因此kdm6b在衰老和骨/牙组织再生中的作用使其成为老年性疾病的防治的候选靶点，但如何有效的调控kdm6b的功能尚不清楚，必须对其的调控机制进行深入研究。查阅文献发现，在hek293细胞中wdr5可以与kdm6b形成蛋白复合体。为了验证这一结果，我们在骨髓间充质干细胞和根尖牙乳头干细胞中均进行了co-ip实验，结果发现，kdm6b和wdr5在两种细胞中可以形成蛋白复合体。衰老的动物模型中，18-24月龄的c57小鼠和人类年龄的56-69岁高度匹配，可以更准确的模拟间充质干细胞老化的状态。因此我们对2月龄小鼠和18月龄小鼠的骨髓间充质干细胞进行co-ip实验。结果显示，和年轻小鼠相比，衰老小鼠的骨髓间充质干细胞中kdm6b/wdr5蛋白复合体形成增多。wdr5参与调控众多细胞生理活动，如上皮间充质转化、白血病发生、软骨细胞和骨细胞的分化、维持胚胎干细胞的多潜能性等。并且，wdr5与组蛋白的甲基化作用对脊椎动物的生长发育有着非常重要的作用。但是，目前关于wdr5对间充质干细胞成骨/成牙向分化以及衰老的影响还缺乏一定的研究。基于以上的结果，我们推测wdr5可以负向调控kdm6b对间充质干细胞的作用。此外，wdr5特殊的蛋白质结构使其扮演了一个中心的脚手架角色，可以与多种蛋白质形成复合物，对干细胞分化，增殖和抗病毒作用进行调控。有研究发现wdr5是催化h3k4me3转移酶，mll1复合体活性的关键共结合蛋白。因此在研究wdr5对干细胞调控作用时，mll1对其的影响也十分需要关注。基于以上的结果，提示我们，wdr5可能是kdm6b和mll1间充质干细胞功能调控的负向调节因子。为了证实这一猜想，我们通过蛋白微阵列技术发现kdm6b/
wdr5蛋白复合体存在7条结合位点：
[0061]
37r e s r v q r s r m d s s v s(如seq id no.3所示)；
[0062]
93c e t l v e r v g r s a t d p(如seq id no.4所示)；
[0063]
102fitc-(acp)-keksrrvlgnldlqsygrkkrrqrrr(如seq id no.1所示)；
[0064]
114fitc-(acp)-adltishcaadvvraygrkkrrqrrr(如seq id no.2所示)；
[0065]
128s r s h t t i a k y a q y q a(如seq id no.5所示)；
[0066]
152fitc-(acp)-ivpmihvswnvartvygrkkrrqrrr(如seq id no.6所示)；
[0067]
153v a r t v k i s d p d l f k m(如seq id no.7所示)。
[0068]
其中102、114、152三个位点显示结合程度最高。随后，我们构建出生物活性多肽，进行细胞刺激最适浓度的筛查，通过体外alp结果检测，发现10ug/ml为最适浓度。利用多肽102、114、152刺激细胞进行co-ip实验，发现152不能有效的阻断kdm6b和wdr5的结合。为了进一步排除多肽衔接的fitc荧光以及穿模肽对细胞的影响，我们设计了对照组多肽，co-ip结果显示，peptide 102、114确实可以阻断kdm6b/wdr5复合体形成。在此基础上，我们猜想，阻断kdm6b/wdr5蛋白复合体的形成，是否可以增强kdm6b的功能作用，从而恢复衰老条件下干细胞组织修复再生能力。有趣的是，我们通过衰老实验，体外成骨/成牙向分化实验都证实了以上猜想的结果。kdm6b/wdr5阻断多肽102，114可以增强骨髓间充质干细胞和根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙定向分化能力和抗衰老能力。并且，kdm6b/wdr5阻断多肽102，114可以挽救衰老的小鼠骨髓间充质干细胞骨向分化能力并降低衰老标志物β-gal和p16的表达。为了进一步证实，102、114序列可以阻断kdm6b/wdr5蛋白复合体形成。我们将带有ha标签的kdm6b的质粒中102和114的序列分别去除后转染根尖牙乳头干细胞，进行co-ip实验，再次证实了突变peptide 102、114序列阻断kdm6b/wdr5复合体形成。并且两个片段都增强了kdm6b促进间充质干细胞骨/牙向分化和抗衰老能力。
[0069]
总之，我们的研究表明，wdr5可能是负调控组蛋白去甲基化酶kdm6b和mll1功能的共结合蛋白。在机制研究的基础上，我们针对kdm6b与wdr5结合区域序列，研发及利用小分子多肽，通过调控kdm6b/wdr5复合体的结合来调节间充质干细胞的功能。最终达到在衰老条件下恢复间充质干细胞功能，从而促进骨/牙组织的修复再生。进一步研究发现，小分子多肽具有骨质疏松、牙周炎的防治作用。
[0070]
实验细胞：
[0071]
根尖牙乳头干细胞(scaps)来源：选取首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面牙槽外科门诊拔除的正畸减数牙或阻生第三磨牙，均在患者(16-22岁)知情同意下收集，要求患者无全身系统性疾病、所收集牙齿无牙体及牙周疾病，进行原代细胞培养。
[0072]
人骨髓间充质干细胞(bmscs)来源：购买于sciencell公司。
[0073]
c57bl/6小鼠骨髓间充质干细胞来源：分别选取2月龄和18月龄的c57bl/6小鼠，进行原代细胞培养。
[0074]
293t细胞购自苏州吉玛基因有限公司。实验用scaps和bmscs均为第3-5代细胞。实验动物：
[0075]
2月龄和18月龄雄性c57bl/6小鼠购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
[0076]
主要设备：
[0077][0078]
主要试剂：
[0079]
[0080][0081]
统计学分析：
[0082]
采用spss 19.0统计学软件进行统计学分析，两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用anova分析，以p《0.05有统计学差异为依据。
[0083]
表1缩略语/符号说明
[0084]
英文缩写
ꢀꢀꢀꢀꢀ
英文全称
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
中文全称
[0085]
alp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
alkaline phosphatase
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
碱性磷酸酶
[0086]
bmscs
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bone mesenchymal stem cells
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骨髓mscs
[0087]
bsp
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bone sialoprotein
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骨涎蛋白
[0088]
co-ip
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co-immunoprecipitation
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免疫共沉淀
[0089]
dmso
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dimethyl sulfoxide
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二甲基亚砜
[0090]
dspp
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dentin sialophosphoprotein
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牙本质涎磷蛋白
[0091]
fbs
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fetal bovine serum
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胎牛血清
[0092]
kdm6b
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lysine(k)-specific demethylase 6b
ꢀꢀꢀꢀ
组蛋白去甲基化酶6b
[0093]
kdm3b
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
lysine(k)-specific demethylase 3b
ꢀꢀꢀꢀ
组蛋白去甲基化酶3b
[0094]
mscs
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mesenchymal stem cells
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
间充质干细胞
[0095]
mll1
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mixed lineage leukemia 1
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混合系白血病1
[0096]
ocn
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osteocalcin
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骨钙素
[0097]
osx
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osterix
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成骨相关转录因子
[0098]
opn
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osteopontin
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骨桥蛋白
[0099]
pbs
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phosphate buffered saline
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磷酸盐缓冲液
[0100]
runx2
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runt-related transcription factor 2
ꢀꢀ
runt相关转录因子2
[0101]
scaps
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apical papilla stem cells
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根尖牙乳头干细胞
[0102]
tert
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
telomerase reverse transcriptase
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端粒酶逆转录酶
[0103]
wdr5
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wd repeat domain 5
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
wd重复蛋白5
[0104]
β-gal
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β-galactosidase
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β-半乳糖苷酶
[0105]
α-mem
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αminimal essential medium
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
α-最低必需培养基
[0106]
本发明提供的kdm6b的多肽序列及对间充质干细胞功能的调控应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0107]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0108]
实施例1间充质干细胞的获取、分离和培养
[0109]
(1)人根尖牙乳头干细胞分离培养
[0110]
在患者知情条件下，局麻下无菌拔出患者的正畸减数牙或者第三磨牙，并将离体牙放置于提前准备好的含有双抗的pbs无菌离心管中。超净台中，无菌刀片刮取牙根尖部位牙乳头组织。用大量含有双抗的pbs反复清洗取下的牙乳头组织后，将其放入含有ⅰ型胶原酶(3g/l)和dispase(4g/l)1:1配制消化液中并将其剪碎。37℃孵箱消化40分钟后加入2倍体积的培养基中终止消化，将细胞收集至15ml无菌离心管中。1100rpm/min离心6分钟，弃掉上清，加入培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，接种于60mm培养皿中，在37℃、5％co2孵箱培养。培养3天后，显微镜下观察细胞生长状况，更换新鲜的培养基，当细胞生长至约80％融合状态时，用0.25％胰蛋白酶消化，按1:2传代于100mm培养皿中。
[0111]
(2)c57bl/6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养
[0112]
小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡5分钟，超净台内剥离四肢皮肤后，小心剔除胫骨、股骨、肱骨表面肌肉及筋膜，眼科剪剪除长骨两端关节，使用1ml注射器抽取37℃恒温的α-mem培养基，配2号针头，将长骨内骨髓冲入5cm培养皿。于37℃、5％co2培养，5天后观察到细胞克隆形成后，使用0.25％胰蛋白酶传代至大皿中，每2～3天换液一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用胰蛋白酶按照1：3消化传代。
[0113]
实施例2细胞培养和成骨/成牙向诱导分化
[0114]
间充质干细胞培养于sciencell间充质干细胞培养基中，并置于37℃、5％co2细胞孵箱中。原代细胞培养3-5代时，用于进行细胞实验。待细胞准备好后，将细胞用胰蛋白酶消化为单细胞，细胞计数仪计数3.0
×
105的细胞铺于6孔板中。待细胞数目增长到80％-90％后进行成骨诱导。三天换液一次。
[0115]
实施例3间充质干细胞的冻存与复苏
[0116]
(1)冻存
[0117]
细胞在冻存前一天更换细胞培养基。提前将使用的枪头、移液器、离心管等实验用品放入超净台中消毒30分钟。pbs清洗细胞2次后，用0.25％胰蛋白酶37℃消化2分钟，倒置显微镜下观察细胞漂浮并成为单细胞后，加入3倍体积的培养基终止消化。将消化下来的细胞吹悬，混匀后转移至15ml离心管中，1100rpm/min离心6分钟。去除离心管中上清，加入冻存液，混匀细胞后分装于冻存管中，置于-80℃冰箱过夜后放于液氮罐中长期储存。冻存管
中标记好细胞名称，代数和日期。
[0118]
(2)复苏
[0119]
提前将使用的枪头、移液器、离心管等实验用品放入超净台中消毒30分钟。将培养基从冰箱取出放置于孵箱中预热。戴好面罩和手套，将储存于液氮中的细胞取出，迅速将其放置于37℃的水浴锅中不断摇晃使其溶化。从水浴锅中取出融化的细胞，用75％酒精擦拭消毒，在超净台中将冻存管打开，将细泡悬液吸出，移入盛有培养基的离心管中，1100rpm离心6min。弃除上清，加入培养基，吹打混匀细胞，接种到培养皿中，在37℃、5％co2培养箱中培养。
[0120]
实施例4病毒包装和细胞转染
[0121]
(1)构建病毒质粒
[0122]
通过ncbi数据库平台https://www.ncbi.nlm.nih.gov/查询kdm6b、wdr5、mll1的基因序列，应用whitehead提供的程序设计kdm6b、wdr5、mll1的sirna，将其插入慢病毒的shrna载体plko.1上，测序鉴定，最终构建成kdm6b shrna、wdr51shrna、mll1shrna的质粒。采用基因合成的方法得到加表面标签ha tag的kdm6b基因全长以及myc tag的wdr5基因全长，将其连接到逆转录病毒pqcxin的表达载体上，测序鉴定，最终构建成kdm6b、wdr5的过表达质粒。采用基因合成的方法得到加表面标签ha tag的kdm6b基因全长并将102和114位点序列去除，随后将其连接到逆转录病毒pqcxin的表达载体上，测序鉴定，最终构建成突变102、114位点的kdm6b的过表达质粒。pqcxin作为空载体对照。
[0123]
(2)包装病毒
[0124]
对照scramble shrna(scramsh)、kdm6b shrna(kdm6bsh)、wdr5 shrna(wdr5sh)、mll1 shrna(mll1sh)及相应的包装质粒(vsvg和dv-8.2)293t细胞进行转染，转染后48小时，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。逆转录病毒对照空质粒pqcxin，pqcxin-ha-kdm6b、pqcxin-ha-kdm6b-mut102、pqcxin-ha-kdm6b-mut114、pqcxin-myc-wdr5及相应的包装质粒(vsvg和gpz)在293t细胞进行转染；转染后72小时，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。
[0125]
(3)建立稳定转染细胞
[0126]
将细胞接种于培养皿中，待细胞长到50％-60％密度后，更换为6ml培养基，并加入6μg/ml polybrene。分别应用scramsh、kdm6bsh、wdr5sh、mll1sh病毒转染细胞，转染12小时候更换细胞培养基。转染48小时后，用puromycin筛选3天后得到对照scramsh和kdm6b、wdr5、mll1基因敲除的稳定转染细胞，在蛋白及rna水平检测基因敲除效果。对照质粒pqcxin，pqcxin-ha-kdm6b、pqcxin-ha-kdm6b-mut102、pqcxin-ha-kdm6b-mut114、pqcxin-myc-wdr5病毒转染细胞，转染后48小时后用g418筛选7天得到稳定转染细胞，在蛋白及rna水平检测表达鉴定外源性kdm6b、wdr5的表达，得到kdm6b、kdm6b-mut102、kdm6b-mut114、wdr5过表达的稳定转染细胞。
[0127]
实施例5western blot检测蛋白表达变化
[0128]
(1)总蛋白提取
[0129]
待细胞培养时间到达后，提前准备好实验试剂和实验材料，提前将冰制备好。弃掉培养皿中的培养基，取4℃预冷的pbs 5ml将细胞漂洗3次。配制裂解液，ripa、pmsf与pic按100:1:1的比例配好，根据具体情况确定加入量(10cm的培养皿通常500μl)，将其放置到4℃
冰箱孵育20min，每5min将培养皿中的裂解液摇晃使其覆盖皿底。刮取细胞移入1.5ml离心管中。4℃，14000rpm离心15min。将上清吸入1.5ml的ep管中，做好标记，于-80℃保存。
[0130]
(2)蛋白浓度测量(bradford法)
[0131]
取-80℃保存的蛋白样本，冰上快速融化，在96孔板内加入200μl1
×
考马斯亮蓝(biobad)并加入1μl蛋白样本(根据颜色变化决定蛋白上样量)，混匀，排气泡，上机检测od值。绘制标准曲线，等体积等质量上样，按25μg上样(计算蛋白体积，用pbs pmsf pic稀释至20μl，加5μl 5
×
loading buffer。蛋白变性，95℃-100℃ 10min，冰上10min，变性后-20℃保存。
[0132]
(3)电泳
[0133]
取出预成胶，抽出底部绝缘条，将胶和背板正确放置(字体正面均朝向实验者)，加入电泳buffer，外围根据刻度加入可回收的电泳液，加满后再拔掉梳子。抽出预成胶梳子(动作轻柔)，每个孔道内加样，蛋白样本孔道旁加marker，marker加入8μl即可。80v 40min跑浓缩胶，120v跑梯度胶，直至marker跑至底部黑线处，关闭开关。
[0134]
(4)转膜(勿触水)
[0135]
取出预成胶，切除浓缩胶及底部部分胶，将pvdf膜盖在其表面(标记1道位置)，按滤纸-pvdf膜-胶-滤纸的顺序放于转模板上，排气泡，再盖上转膜盒盖，拧紧。转膜(恒压1.3v，7min)，关闭电源，取出pvdf膜(动作快)，1
×
tbst洗三遍，每次5min。封闭：配制溶于1
×
tbst的5％脱脂奶粉，将pvdf膜置于封闭液中，室温孵育1小时，1
×
tbst摇床洗4次，每次10min。
[0136]
(5)孵育一抗、二抗
[0137]
根据内参与目的蛋白分子量差距确定孵育抗体方式：差距大于5kda剪开pvdf膜孵育抗体；差距小于5kda时，分两次孵育抗体。膜放入含合适浓度一抗的tbst牛奶中(包括剪膜后可能需要孵育的gapdh、hsp90等内参)，4℃摇床过夜。将敷过一抗膜用1
×
tbst洗3遍，每次5min。二抗按1：2000稀释，室温下摇床1h。1
×
tbst洗pvdf膜三次，每次5min。
[0138]
(6)显影
[0139]
事先准备好发光液，1:1混合暗室内配置。将pvdf膜放置在暗盒内，将剪开的膜重新恢复好。将发光液滴在pvdf膜上(蛋白所在区域)红光激发2-3min，bio-rad成像系统中成像。
[0140]
实施例6蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-ip)
[0141]
(1)提取细胞总蛋白
[0142]
应用ip裂解液对敲除组细胞和过表达组细胞进行蛋白质提取。敲除组细胞scaps-scramsh和scaps-kdm6bsh，scaps-scramsh和scaps-wdr5sh，bmscs-scramsh和bmscs-wdr5sh分别加入kdm6b抗体、wdr5抗体、igg抗体，4℃旋转摇床过夜，第二天分别加入proteina/g珠子4℃旋转摇床旋转2小时，形成蛋白-抗体-琼脂糖珠复合物，通过wb检测kdm6b和wdr5是否形成蛋白复合体；过表达组细胞scaps-vector、scaps-ha-kdm6b、scaps-ha-kdm6b-mut102和scaps-ha-kdm6b-mut114，scaps-vector和scaps-myc-wdr5分别加入带有ha抗体的proteina/g珠子、myc抗体的proteina/g珠子孵育过夜，形成蛋白-抗体-琼脂糖珠复合物，通过wb检测kdm6b和wdr5是否形成蛋白复合体。
[0143]
(2)分组：input组(25μg上样)；抗体组(800μg上样，2μg抗体)；igg组(800μg上样2μ
g抗体)，用裂解液稀释样本。
[0144]
(3)准备protein a/g beads
[0145]
用pbs洗4次，2000g，2min，小心吸取上清，加入pbs，使protein a/g beads含量为50％，每管加入30μl protein a/g beads，4度旋转过夜。
[0146]
(4)4度5000rpm，30s，pbs洗4-5次上下颠倒即可，最后一次离心去上清，加入30μl的2
×
loading buffer，100度煮沸5min。
[0147]
(5)取上清，电泳。
[0148]
实施例7成骨/成牙诱导实验
[0149]
(1)成骨培养基，购自美国invitrogen公司。
[0150]
(2)碱性磷酸酶(alp)活性定量检测
[0151]
1)成骨诱导3天后，弃去培养基，pbs洗两次；
[0152]
2)加入500μl lysis buffer，37℃，孵育15min；
[0153]
3)刮取细胞移入1.5mlep管中，于4度离心机以转速14000rpm，离心10分钟，将上清移入新的ep管(测蛋白浓度，步骤同western blot)；
[0154]
4)取碱性磷酸酶试剂盒中的胶囊(stock substrate sol.)，加入5ml蒸馏水剧烈震荡，使其充分溶解混匀；
[0155]
5)取50μl alp缓冲液加入50μl stock substrate sol，96孔板内每孔加入100μl，再加入样本10μl，混匀，另设空白孔，不加样本，调零用；
[0156]
6)37℃孵育15min，405nm处测od值。
[0157]
y＝18.904*x-0.2817(x＝od值)
[0158]
结果＝y/孵育时间/蛋白浓度
[0159]
(3)茜素红染色
[0160]
1)细胞成骨诱导两周后，弃去培养基，用4度预冷的pbs漂洗3次，70％乙醇固定，4℃，1h；
[0161]
2)双蒸水洗2次，用40mm茜素红溶液(ph4.2)室温染色10min，肉眼观察到着色情况；
[0162]
3)用双蒸水洗3次。
[0163]
(4)ca
2
浓度测定
[0164]
为了定量测定钙的含量，在室温条件下，加入10％氯化十六烷吡啶溶解30分钟。用分光光度计在562nm处测od值，通过标准钙离子浓度曲线计算样本的钙离子浓度，总蛋白质浓度作为内参。
[0165]
实施例8细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶染色实验
[0166]
实验开始前，将试剂盒里的genmed染色液(reagent e)从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化。然后移取9.5毫升genmed稀释液(reagent d)到15毫升锥形离心管，加入500微升genmed染色液(reagent e)，混匀后，置入37℃恒温水槽里预热，标记为genmed染色工作液。然后进行下列操作：
[0167]
(1)小心抽去24孔细胞培养板里的培养液；
[0168]
(2)每孔加入500微升genmed清理液(reagent a)，清洗生长中的细胞表面；
[0169]
(3)小心抽去每孔里的清理液；
[0170]
(4)每孔加入500微升genmed固定液(reagent b)，覆盖整个生长表面；
[0171]
(5)在室温下孵育5分钟；
[0172]
(6)小心抽去固定液；
[0173]
(7)每孔加入500微升genmed酸性液(reagent c)，清洗细胞表面；
[0174]
(8)小心抽去酸性液；
[0175]
(9)重复实验步骤7和8一次；
[0176]
(10)每孔加入400微升预热的genmed染色工作液，覆盖整个细胞表面；
[0177]
(11)放进37℃培养箱，孵育3小时至16小时，或细胞呈现蓝色(注意：避免液体蒸发)；
[0178]
(12)在光学显微镜下观察和计数：表达衰老特异性β-半乳糖苷酶的细胞为阳性细胞，呈现蓝色。
[0179]
实施例9端粒酶逆转录酶elisa实验
[0180]
(1)检测前准备：利用标准品浓度梯度400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml计算出标准曲线；
[0181]
(2)每孔加100μl标准品和样品。用提供的封板膜覆盖，37℃孵育2小时。封板膜表面记录样本名称；
[0182]
(3)把每孔样本弃掉并甩干，不用清洗；
[0183]
(4)每孔加入100μl biotin-antibody(1x)。用新封板膜覆盖，7℃孵育1小时。biotin-antibody(1x)可能出现浑浊，加热至室温，轻轻搅拌至溶解消失；
[0184]
(5)每孔样本弃掉并用wash buffer洗涤，重复这个过程两次，总共洗涤三次。清洗时使用排枪，每次加入200μl wash buffer，每次静置2分钟，每一步完全去除液体是良好性能的关键。最后一次洗涤后，弃去wash buffer把96孔板倒过来，用干净的纸巾吸干。
[0185]
(6)每孔加入100μl hrp-avidin(1x)，用新的封板膜覆盖微量滴定板，37℃孵育1小时；
[0186]
(7)重复第6步的弃液/洗涤过程5次；
[0187]
(8)每孔加入90μl tmb substrate。37℃孵育15-30分钟，避光保护。每孔加入50μl stop solution，轻拍板，确保充分搅拌。
[0188]
(9)使用设置为450nm的微孔读取器，在5分钟内确定每个孔的光密度。
[0189]
实施例10多肽微阵列与重组蛋白结合反应检测
[0190]
(1)多肽芯片合成：根据kdm6b蛋白的序列合成多肽芯片，overlapping设计，共两个阵列。
[0191]
(2)多肽阵列合成：活化过的基质芯片膜放置于全自动多肽芯片合成仪上，根据程序自动转移fmoc-氨基酸溶液到活化膜上的特定位置与膜进行反应。膜按序浸入封闭液i中和封闭液ii中，进行侧链封闭，dmf洗膜。膜放入去保护溶液中，用于移除氨基端的fmoc保护基团，去保护之后，用dmf洗膜，而后再用乙醇干燥。重复以上步骤，直至多肽阵列全部合成完毕。全部合成后，用特定的有机试剂去除侧链保护基团，再用ch2cl2洗膜，而后用乙醇干燥,立即使用或-20℃保存。
[0192]
(3)封闭：将多肽微阵列芯片活化后加入封闭液，室温下震荡封闭4小时，洗涤芯片；
[0193]
(4)目标蛋白的生物素标记：取蛋白样品wdr5合成蛋白(浓度1.5mg/ml)1ml，用ez-link nhs-peo4-biotinylation kit(prod#21455)进行蛋白标记；
[0194]
(5)标记蛋白样品与多肽芯片孵育：用封闭液稀释的生物素标记的wdr5合成蛋白样品(终浓度1ug/ml)，用5ml与多肽微阵列芯片混合，4度孵育过夜，对照组用封闭液孵育；
[0195]
(6)streptavidin-hrp孵育：反应试剂streptavidin-hrp孵育(high sensitivity streptavidin-hrp(prod#21133))，封闭液稀释(1:10000)后，用5ml孵育多肽微阵列芯片，室温震荡2小时，洗涤芯片；
[0196]
(7)显色：加入ecl发光试剂，chempchemi数字成像仪，数字成像。
[0197]
(8)芯片扫描及显色点数据分析：显色芯片使用chempchemi化学发光成像系统425nm扫描成像，显色时长200s。成像图片使用totallab图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“spot edge average”算法，以每个显色点周边背景值为参照计算每个显色点的光密度值。
[0198]
效果例1kdm6b/wdr5对骨髓间充质干细胞衰老和成骨向分化的影响及调控机制的研究
[0199]
kdm6b对骨髓间充质干细胞衰老的影响及调控机制的研究
[0200]
1.2在骨髓间充质干细胞中wdr5可以与kdm6b、mll1形成蛋白复合体
[0201]
为了明确wdr5与kdm6b、mll1是否可以形成蛋白复合体，我们对稳定敲除wdr5的骨髓间充质干细胞进行co-ip实验。co-ip实验结果表明，和对照组相比，wdr5敲除组的骨髓间充质干细胞中，wdr5与kdm6b、mll1蛋白复合体形成减少(图1)。
[0202]
1.3衰老小鼠的骨髓间充质干细胞中wdr5与kdm6b和mll1的结合明显增多
[0203]
为了明确衰老条件下kdm6b、wdr5、mll1对间充质干细胞的调控作用，我们对2月龄c57bl/6小鼠和18月龄c57bl/6小鼠进行co-ip实验检测蛋白复合体形成情况。co-ip实验结果表明，和对照组相比，衰老c57bl/6小鼠的骨髓间充质干细胞中，wdr5和kdm6b、mll1复合体形成增多(图1～2)。
[0204]
效果例2kdm6b/wdr5蛋白复合体对骨髓间充质干细胞的成骨向分化能力的影响及调控机制的研究
[0205]
3.1kdm6b/wdr5存在7条结合位点，多肽102和114有效阻断kdm6b/wdr5蛋白复合体形成
[0206]
为了深入研究kdm6b对骨髓间充质干细胞的功能调控机制，课题组应用多肽微阵列技术发现kdm6b/wdr5蛋白复合体结合位点序列。多肽微阵列技术发现wdr5和kdm6b存在7个阳性结合位点(图3a)。阳性多肽结合位点的选择遵循：点光密度值超过30％且阴性反应膜上点光密度值低于30％。芯片杂交灰度值分析发现，7个结合位点中102，114，152三者结合程度最高(图3b)。根据结合位点分析及序列设计，合成peptide102、peptide114、peptide152。
[0207]
peptide102：fitc-(acp)-keksrrvlgnldlqsygrkkrrqrrr；
[0208]
peptide114：fitc-(acp)-adltishcaadvvraygrkkrrqrrr；
[0209]
peptide152：fitc-(acp)-ivpmihvswnvartvygrkkrrqrrr。
[0210]
通过co-ip结果检测发现，102、114、152三条生物活性多肽中，只有peptide102、peptide114可以有效打开kdm6b/wdr5蛋白复合体的结合(图3c)。
[0211]
3.2多肽102，114抑制骨髓间充质干细胞衰老，促进骨髓间充质干细胞成骨向分化
[0212]
我们同时研究peptide102和peptide114对骨髓间充质干细胞的功能影响。端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，peptide114促进骨髓间充质干细胞端粒酶逆转录酶表达(图4a)。β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致骨髓间充质干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少(图4b，c)。在成骨培养基诱导3天后，我们发现和对照组相比，peptide102和peptide114促进骨髓间充质干细胞的alp活性(图4d)。在成骨诱导培养基中培养2周后进行茜素红染色和钙定量分析。结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组骨髓间充质干细胞矿化能力显著升高(图4e，f)。
[0213]
表2图4a的数据
[0214]
ꢀꢀ
sdmock0.0117140.000928673control peptide0.0143490.000934984102peptide0.0223630.000953919114peptide0.0388780.002975362
[0215]
表3图4b的数据
[0216][0217][0218]
表4图4d的数据
[0219]
mock3.4351710.39624control peptide3.2629090.064275102-peptide4.2179770.07766114-peptide4.6205640.191912
[0220]
表5图4f的数据
[0221]
ꢀꢀ
sdmock1.3672420.042852control peptide1.3683830.04055102peptide1.5841580.015308114peptide1.8067830.063106
[0222]
3.3多肽102，114抑制衰老小鼠骨髓间充质干细胞衰老，促进衰老骨髓间充质干细胞成骨向分化
[0223]
为了证实生物活性多肽102、114可以对衰老骨髓间充质干细胞发挥功能调控作用，我们进行了衰老以及分化功能相关实验。β-gal染色结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致衰老骨髓间充质干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少(图5a)。在成骨培养基诱导3天后，我们发现和对照组相比，peptide102和peptide114促进衰老骨髓间充质干细胞的alp活性(图5b)。在成骨诱导培养基中培养2周后进行茜素红染色和钙
定量分析。结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组衰老骨髓间充质干细胞矿化能力显著升高(图5c，d)。
[0224]
表6图5b的数据
[0225]
ꢀꢀ
sdmock6.025530.264389control peptide5.7637490.432205102-peptide6.9507720.156132114-peptide7.6117310.242683
[0226]
表7图5d的数据
[0227]
mock1.0823960.006429control peptide1.1036770.011295102peptide1.1539780.012147114peptide1.2512940.009707
[0228]
效果例3wdr5对间充质干细胞衰老和成牙向分化能力的影响及调控机制的研究
[0229]
5.1在根尖牙乳头干细胞中kdm6b可以与wdr5形成蛋白复合体
[0230]
为了进一步研究kdm6b对根尖牙乳头干细胞的调控机制，我们通过co-ip实验对kdm6b和wdr5两者的结合情况进行了检测。co-ip实验结果发现，和对照组相比，敲除kdm6b组根尖牙乳头干细胞中kdm6b和wdr5结合明显减少(图6a)。为了进一步证实kdm6b和wdr5可以形成蛋白复合体，我们对稳定敲除wdr5的根尖牙乳头干细胞进行co-ip实验。co-ip实验结果表明，和对照组相比，敲除wdr5组细胞中kdm6b和wdr5蛋白复合体形成减少(图6b)。
[0231]
效果例4kdm6b/wdr5蛋白复合体对间充质干细胞的成牙向分化能力的影响及调控机制的研究
[0232]
7.1突变kdm6b序列102、114位点，抑制根尖牙乳头干细胞衰老促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化
[0233]
我们为了进一步确定102，114序列可以阻断kdm6b/wdr5蛋白复合体的形成，我们对转染突变102和114位点的过表达kdm6b细胞进行co-ip实验。实验结果显示，和ha-kdm6b组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114中kdm6b和wdr5结合减少(图7a)。随后检测突变102和114位点的过表达kdm6b对根尖牙乳头干细胞衰老的影响。端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114促进根尖牙乳头干细胞端粒酶逆转录酶表达(图7b)。β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114导致根尖牙乳头干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少(图7c，d)。在成牙培养基诱导3天后，我们发现和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114促进根尖牙乳头干细胞的alp活性(图7e)。在成牙诱导培养基中培养2周后进行茜素红染色和钙定量分析。结果显示，和对照组相比，ha-kdm6b-mut102组和ha-kdm6b-mut114组矿化能力显著升高(图7f，g)。
[0234]
表8图7b的数据
[0235]
ꢀꢀ
sdvector0.1203010.002321238
ha-kdm6b0.1514280.001219ha-kdm6b-mut1020.1488490.002428533ha-kdm6b-mut1140.1671240.001247402
[0236]
表9图7d的数据
[0237] meansdvector29.440523.676117107ha-kdm6b18.27460.752269296ha-kdm6b-mut10211.746831.302423965ha-kdm6b-mut11413.158760.433142542
[0238]
表10图7e的数据
[0239]
ꢀꢀ
sdvector0.1168580.005575ha-kdm6b0.284320.069515ha-kdm6b-mut1020.4595540.082139ha-kdm6b-mut1140.7515550.133336
[0240]
表11图7g的数据
[0241]
vector0.7041620.004041ha-kdm6b0.8652510.008312ha-kdm6b-mut1021.2350370.007506ha-kdm6b-mut1141.2124320.071305
[0242]
7.2多肽102，114抑制根尖牙乳头干细胞衰老，促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化
[0243]
在前期研究的基础上，进一步针对kdm6b与wdr5结合区域序列，研发及利用小分子生物活性多肽，通过调控kdm6b/wdr5复合体的结合来调节根尖牙乳头干细胞的功能。我们对生物活性多肽处理的根尖牙乳头干细胞进行co-ip实验。实验结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组根尖牙乳头干细胞中kdm6b和wdr5结合减少(图8a)。随后检测peptide102和peptide114对根尖牙乳头干细胞衰老的影响。端粒酶逆转录酶elisa实验结果表明，和对照组相比，peptide114促进根尖牙乳头干细胞端粒酶逆转录酶表达(图8b)。β-gal染色及定量分析结果表明，和对照组相比，peptide102和peptide114导致根尖牙乳头干细胞β-gal阳性细胞数量明显减少(图8c，d)。在成牙培养基诱导3天后，我们发现和对照组相比，peptide102和peptide114促进根尖牙乳头干细胞的alp活性(图8e)。在成牙诱导培养基中培养2周后进行茜素红染色和钙定量分析。结果显示，和对照组相比，peptide102和peptide114组根尖牙乳头干细胞矿化能力显著升高(图8f，g)。
[0244]
7.3kdm6b和wdr5存在共同调控下游靶基因。
[0245]
表12图8b的数据
[0246]
ꢀꢀ
sdmock0.0326080.001955173control peptide0.0305420.002918559102peptide0.0333120.004895822
114peptide0.0516770.001020189
[0247]
表13图8d的数据
[0248]
ꢀꢀ
sdmock25.078612.419658control peptide24.202050.643601102peptide7.296240.448604114peptide3.9781560.35091
[0249]
表14图8e的数据
[0250]
ꢀꢀ
sdmock0.2183030.087875control peptide0.2857430.012709102peptide0.3961210.038258114peptide0.7237590.003245
[0251]
表15图8g的数据
[0252]
mock1.289380.031225control peptide1.2096920.033382102peptide1.637360.016823114peptide1.6190930.032005
[0253]
效果例5
[0254]
1.小型猪牙周炎模型新骨形成体积(mm3)，如表16和图9所示。
[0255]
表16图9的数据
[0256]
pbscontrol peptide114peptide23.7326.6980.6848.0669.2779.0821.9647.6380.4823.938.376.4816.8532.2585.4937.6433.48101.99
[0257]
2.小型猪牙周炎模型临床探诊指标
[0258]
建立小型猪实验性牙周炎骨缺损模型
[0259]
建模方法：采用制造骨缺损及结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型。具体方法：小型猪常规麻醉，口外消毒，选取小型猪下颌第一恒磨牙为实验牙，做沟内切口及垂直切口，翻开黏骨膜瓣后，采用去骨方法暴露小型猪下颌第一恒磨牙近中颊根，并做3mm
×
5mm
×
7mm大小的骨缺损。即：去除近中邻面牙槽骨3mm
×
5mm
×
7mm、去除近中颊根颊侧骨板及远中牙槽骨(3mm
×
5mm，龈向深度平近中邻面)；原位缝合。牙颈部结扎丝线。术后4周骨缺损将不能自行修复，可成功形成牙周炎骨缺损模型。ct影像学及临床检查结果验证牙周炎骨缺损模型的建立。
[0260]
生物活性多肽114再生修复小型猪实验性牙周炎骨缺损
[0261]
12只五指山小型猪建立牙周炎模型，共24侧，随机分为3组，每侧注射药物剂量为60ul：第1组：在建模后做翻瓣刮治 无菌生理盐水注射(未治疗对照组)；第2组：在建模后做翻瓣刮治 对照多肽注射(对照组)；第3组：在建模后做翻瓣刮治 生物活性多肽114注射(实验组)。
[0262]
在建模手术后4w进行药物注射治疗。通过比较造模后4周(-4w)，未药物注射(0w)及药物治疗后3个月(12w)的临床指标检查、影像学检查，观察生物活性多肽114对干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响。
[0263]
ct影像学、geomagic studio 12、mimics medical 17骨计量分析、临床检查结果结果表明生物活性多肽114促进间充质干细胞介导的牙周组织再生。
[0264]
治疗后观察指标
[0265]
临床、影像学、组织学指标的观察
[0266]
分别在实验前、建模后(-4w)和治疗后3个月(12w)进行临床指标(pd、al、gr)和ct影像学检查。
[0267]
牙周探诊深度(probing depth，pd)：以20～25g的探诊压力，记录牙齿近中颊侧的牙周袋深度。
[0268]
牙龈退缩(gigival recession,gr)：使用牙周探针，测量釉牙骨质界至牙龈缘的距离。如有牙龈退缩，釉牙骨质界暴露，龈缘位于釉牙骨质界的根方，则二者间的距离记为正值；如牙龈无退缩，龈缘位于釉牙骨质界的冠方，则记为负值。
[0269]
附着丧失(attachment loss，al)：将袋深度减去gr即为附着丧失的程度。若两数相减为零，或不能探到釉牙骨质界，说明无附着丧失，若牙龈退缩使龈缘位于釉牙骨质界的根方，则将两个读数相加，得出附着丧失的程度。
[0270]
2.1probing depth(pd)：如表17和图10所示。
[0271]
表17图10的数据
[0272][0273]
其中，
“‑”
：死了一只实验动物，因此，缺少一组数据。
[0274]
小型猪牙周炎模型在注射生物活性多肽12周后，通过牙周探针测量发现，114peptide组牙周探诊深度明显低于pbs组及control peptide组；114peptide组与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0275]
2.2attachment loss(al)：如表18和图11所示。
[0276]
表18图11的数据
[0277][0278]
2.3gingival recession(gr)：如表19和图12所示。
[0279]
小型猪牙周炎模型在注射生物活性多肽12周后，通过牙周探针测量发现，114peptide组附着丧失情况明显低于pbs组及control peptide组；114peptide组与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0280]
表19图12的数据
[0281][0282]
其中，
“‑”
：死了一只实验动物，因此，缺少一组数据。
[0283]
小型猪牙周炎模型在注射生物活性多肽12周后，通过牙周探针测量发现，114peptide组牙龈退缩程度明显低于pbs组及control peptide组；114peptide组与其余组间差异有显著性意义；*p≤0.05；
[0284]
cbct三维建模如图13所示，受检小型猪平卧于cbct扫描机床上，取自然咬位，头部固定，连续扫描获取cbct断层图像并使用mimics17.0图像处理软件对dicom图像三维重建。在建模前、建模后及术后分别获取cbct数据用于治疗后评估；术后三维重建模型显示pbs组/control peptide组/114peptide均有新骨形成；114peptide组新骨形成效果优于control peptide组和pbs空白对照组；
[0285]
口内照片如图14所示，小型猪牙周炎模型在注射生物活性多肽12周后，小型猪牙周组织骨缺损区pbs组/control peptide组/114peptide组伤口均有愈合，未见感染及坏死组织；114peptide组软组织修复效果优于control peptide组和pbs组。
[0286]
效果例6
[0287]
1、腭部黏膜缺损
[0288]
balb/c8月龄雄性小鼠15只，随机分为pbs组，control组，114组三组，每组5只。缺损建立前以0.2ml/20g注射4％水合氯醛麻醉备皮，用皮钻建立背部正中直径6mm的圆形全皮层缺损，分别于缺损建立当天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天于缺损边缘2mm处，分四个等距位点注射等量pbs、10ul/ml control多肽、10ul/ml114多肽100ul。
[0289]
每次注射前拍摄缺损部位照片，image-pro plus软件计算缺损区域面积，按愈合率＝(0天缺损面积-14/21天缺损面积)/0天缺损面积计算愈合率。t检验p＜0.05，显示14天、21天皮肤缺损愈合率较对照组有统计学意义。
[0290]
结果如图15～16所示以及表20所示。
[0291]
表20图16的数据
[0292]
14-pbs14-control14-11421-pbs21-control21-1148.5539578.0835665.7816274.2593052.5985922.2592077.1390767.1876247.2535952.0668622.1599280.33192437.3938137.3066288.2308193.9305762.1340381.9637867.6934497.5031325.5204003.4189145.3623772.3297627.6950747.5202376.4005983.4189143.0637342.213450
[0293]
通过统计pbs组、controlpeptide组和114peptide组在第14天和第21天时小鼠腭部粘膜缺损未愈合面积，发现114peptide组与pbs空白对照组、control peptide组相比有显著统计学差异；*p≤0.05。
[0294]
2、皮肤缺损
[0295]
balb/c8月龄雄性小鼠15只，随机分为pbs组，control组，114组三组，每组5只。缺损建立前以0.2ml/20g注射4％水合氯醛麻醉备皮，用皮钻建立背部正中直径6mm的圆形全皮层缺损，分别于缺损建立当天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天于缺损边缘2mm处，分四个等距位点注射等量pbs、10ul/ml control多肽、10ul/ml114多肽100ul。
[0296]
每次注射前拍摄缺损部位照片，image-pro plus软件计算缺损区域面积，按愈合率＝(0天缺损面积-14/21天缺损面积)/0天缺损面积计算愈合率。t检验p＜0.05，显示14天、21天皮肤缺损愈合率较对照组有统计学意义。
[0297]
结果如图17～18以及表21所示。
[0298]
表21图18的数据
[0299][0300]
通过统计pbs组、control peptide组和114peptide组在注射药物后10天、14天时小鼠背部皮肤缺损愈合率，发现114peptide组与pbs组、control peptide组相比有显著统计学差异；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001；
[0301]
3、ovx小鼠骨质疏松模型中预防骨质流失
[0302]
于维通利华购买3月龄c57bl/6小鼠25只，随机分为假手术组，ovx组，pbs组，control peptide组和114peptide组，每组5只。ovx组，pbs组，control peptide组和114peptide组切除双侧卵巢构建骨质疏松模型，假手数组不切除卵巢。卵巢切除6周后对小鼠分别进行腹腔注射，control peptide和114peptide注射剂量为10mg/kg。连续注射3个月后处死。对于股骨远端，使用micro-ct系统对每只小鼠左侧股骨远端进行离体扫描。选取每段骨小梁进行分割，进行三维重建，计算bmd。
[0303]
结果如图19以及表22所示。
[0304]
表22图19b的数据
[0305]
shamovxpbscontrol peptide114peptide0.15510.10600.01910.01580.14400.18480.03550.06120.06000.12420.14900.08630.10430.08940.14160.22420.02030.06590.09780.10710.14210.01430.04150.04000.1137
[0306]
通过对小鼠股骨干垢端micro-ct分析，发现注射pbs和control peptide组的小鼠，股骨骨小梁骨密度和ovx组小鼠没有明显差异；ovx组，pbs组，control peptide组和sham组进行对比，骨小梁骨密度出现明显下降；114peptide组小鼠骨小梁骨密度和ovx组，pbs组，control peptide组相比，骨小梁骨密度明显上调。
[0307]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.蛋白复合体作为靶标在制备抑制间充质干细胞衰老、促进间充质干细胞成骨向分化或成牙向分化的试剂或药物中的应用；所述蛋白复合体包括第一蛋白复合体和第二蛋白复合体；所述第一蛋白复合体包括wdr5和kdm6b；所述第二蛋白复合体包括kdm6b、wdr5和mll1。2.生物活性肽，其特征在于，其具有：(i)、如seq id no.1或2所示的氨基酸序列；(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。3.如权利要求2所述生物活性肽在制备间充质干细胞衰老、促进骨髓间充质干细胞成骨向分化和/或促进根尖牙乳头干细胞成牙向分化的试剂或药物中的应用。4.如权利要求2所述生物活性多肽在制备骨质疏松、牙周炎防治和/或黏膜及皮肤缺损修复的试剂或药物中的应用。5.试剂或药物，其特征在于，包括如权利要求2所述生物活性肽以及药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明涉及生物医学领域，特别涉及KDM6B对间充质干细胞功能的调控应用。WDR5是负调控组蛋白去甲基化酶KDM6B和MLL1功能的共结合蛋白。WDR5可以与组蛋白去甲基化酶KDM6B形成蛋白复合体，抑制KDM6B的功能，进而通过调控下游衰老以及成骨相关基因，基因启动子区域组蛋白的甲基化状态调控基因的表达及功能，最终达到调节干细胞衰老和分化功能及骨/牙组织修复再生功能的作用。针对KDM6B与WDR5结合区域序列，研发及利用小分子多肽，通过调控KDM6B/WDR5复合体的结合来调节间充质干细胞的功能。最终达到在衰老和骨质疏松条件下恢复间充质干细胞功能，从而促进骨/牙组织的修复再生。从而促进骨/牙组织的修复再生。


技术研发人员：范志朋 张琛 姜钰 龙璐珏 曹杨杨
受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京口腔医院
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/5/25