一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法与流程

1.本发明属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法。


背景技术：

2.肿瘤干细胞（cscs）是一种具有类似于体细胞干细胞能力的癌细胞亚群。cscs在肿瘤的发生、转移、复发和耐药过程中起着关键作用。绝大部分的肿瘤被认为起源于cscs，这可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。目前已知有少数几种人类肿瘤，可自发性地从未分化的恶性肿瘤退变为完全良性肿瘤，而神经母细胞瘤细胞分化为神经元细胞就属于其中之一。
3.随着干细胞与再生医学技术的不断发展，干细胞这一具有无限自我更新复制以及分化再生能力的原始细胞群体，在组织的修复与再生方面展现出了巨大的潜力。因此，很多科研人员开始致力于利用干细胞对退行性神经系统进行修复。而经过科研人员数年的探索，截止到目前为止，干细胞干预神经退行性疾病领域，已相继取得突破，为神经退行性疾病患者带来了新的希望。目前修复神经元的干细胞主要起源于神经干细胞，由于神经干细胞来源及获得比较困难，所以制约着神经再生的研究进展。因此，cscs的定向分化不仅是一种潜在的癌症治疗策略，而且为神经再生修复提供了一种新的思路。
4.目前肿瘤干主要从肿瘤组织及肿瘤细胞系中获得，由于从临床来源的肿瘤组织获得有限，且部分肿瘤组织需要进行临床病理分析，用来分离肿瘤干的大部分肿瘤组织以癌旁组织为主，这也制约着肿瘤干细胞的获取。由于以上原因，越来越多的研究者聚焦在从肿瘤细胞系中分离肿瘤干细胞。
5.在肿瘤干细胞向神经细胞分化的研究中，大部分研究参照神经干细胞向神经元诱导方法为主，其方法为培养过程中去除血清并加入神经营养因子及atra诱导剂为主，此方法促使肿瘤干细胞向神经元分化的能力及效率偏低，且分化后的神经细胞功能有待进一步提高。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明旨在提出一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，通过新的诱导方法，使肿瘤干细胞能够快速向神经元分化，分化后的神经元具备神经元特异性标志物，并具备钠电流信号。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，该方法包括如下步骤：s1、肿瘤干细胞获取；s2、肿瘤干细胞向神经元诱导分化；s21、将肿瘤干细胞接种在分化培养基中培养3-7天，中间每2天换液1次，其中分化
培养基为包含fbs、mem-100x、青链霉素100x、全反式维甲酸atra和姜黄素的dmem/f12完全培养基；s22、将分化后的细胞导入神经元维持培养基中继续培养7-14天，神经元维持培养基为包含bdnf、ngf、mem-100x、青链霉素100x和b27的neurobasal medium a完全培养基。
8.进一步，分化培养基中fbs的体积分数为1%-8%，mem-100x的体积分数为0.5%-2%，青链霉素100x的体积分数为0.1-0.4%，atra的用量为每升1μm-10μm，姜黄素的用量为每升0.5μm-5μm。
9.进一步，每100ml分化培养基中fbs的用量为5ml，mem-100x的用量为1ml，青链霉素100x的用量为200
µ
l，atra的用量为1
µ
m，姜黄素的用量为0.5
µ
m。
10.进一步，神经元维持培养基中bdnf的浓度为10ng/ml-80ng/ml，ngf的浓度为5ng/ml-40ng/ml，mem-100x的体积分数为0.5%-2%，青链霉素100x的体积分数为0.1-0.4%，b27-50x的体积分数为0.5%-4%。
11.进一步，每100ml神经元维持培养基中bdnf的浓度为50ng/ml，ngf的浓度为10ng/ml，mem-100x的用量为1ml，青链霉素100x的用量为200
µ
l，b27-50x的用量为2ml。
12.进一步，在进行s2步骤之前先将得到的肿瘤干细胞使用胰酶消化得到单细胞。
13.进一步，步骤s21的培养条件为：37℃、5% co2培养箱中培养。
14.进一步，步骤s1具体包括如下步骤：1）胶质瘤细胞系u-118mg干性培养；将u-118mg细胞接种在肿瘤干细胞培养基中，培养3-5天，肿瘤干细胞培养基为包含1-40ng/ml的bfgf、1-20ng/ml的egf、0.5-4%的b27-50x、0.1-0.4%青链霉素100x的无血清dmem/f12完全培养基；2）免疫磁珠分选；3）分选后差速贴壁纯化；4）肿瘤干快速扩增。
15.本发明还提供了一种由上述任一项所述的分化方法得到的神经干细胞。
16.相对于现有技术，本发明所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法具有以下优势：本发明所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法在向神经元分化过程中全反式维甲酸（atra）与姜黄素（curcumin）联用，姜黄素协同atra抑制肿瘤干细胞增殖，并通过抑制notch1信号通路促进肿瘤干细胞向神经元分化，展现了较强的向神经元分化的能力，且分化后的神经元具有成熟神经元的标志物，并具有钠离子信号。
附图说明
17.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为本实施例肿瘤干细胞图；图2为本实施例肿瘤干细胞流式鉴定图；图3为本实施例肿瘤干细胞向肿瘤细胞分化图；图4为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后透射光图；
图5为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后βiii tubulin荧光图；图6为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后钠电流i-v曲线图；图7为对比例肿瘤干细胞向神经元分化后透射光图。
具体实施方式
18.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
19.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例
20.肿瘤干细胞向神经元方向分化方法包括如下步骤：1）u-118mg细胞复苏：将癌细胞培养液及dmem/f12基础培养基于水浴锅内预热至37℃，在15ml离心管中加入6ml预热的基础dmem/f12培养基。从液氮罐中取出冻存的u-118mg细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻（解冻程度以冻存管中剩余少量冰晶为宜），然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6 ml基础培养基的离心管中，室温1000 r/min离心5 min，弃去上清液后加入适量培养液，细胞浓度为1
×
105细胞/ml种植于培养瓶中，置于37℃、5%co2培养箱中培养，每2 d进行一次换液处理。
21.2）u-118mg细胞传代：u-118mg细胞生长密度达到培养瓶底面积的95 %以上进行细胞传代。
22.具体步骤：（1）提前将培养基及pbs 37 ℃预热。
23.（2）吸除细胞培养液，加入少量pbs润洗细胞。
24.（3）吸除pbs加入适量胰酶，使胰酶能够覆盖细胞，然后放入37℃、5% co2培养箱中消化3 min左右，当细胞趋于圆形、细胞间隙变大且有少量细胞漂起时加入2倍胰酶体积的培养基终止消化，用枪头轻轻吹打细胞，使细胞完全悬浮。
25.（4）收集细胞悬液，室温1000 r/min离心5 min，吸弃上清，用培养基吹悬，使细胞浓度为1
×
105个细胞/ml种植于培养瓶中，置于37℃、5% co2培养箱中培养。
26.3）肿瘤细胞干性培养：细胞以1
×
105个细胞/ml接种在肿瘤干细胞培养基中培养5天，每100ml培养基包含10ng/ml的bfgf、20ng/ml的egf、2ml的b27-50x、200
µ
l青链霉素100x的dmem/f12无血清完全培养基，并在培养过程中在4℃的环境下培养3次，每次15分钟。
27.4）免疫磁珠分选：严格按照miltenyi biotec磁珠分选说明书进行分选操作，具体步骤如下：（1）pbs清洗u-118mg贴壁细胞以去除死细胞，加胰酶进行消化处理。
28.（2）使用基础培养基重悬细胞，1000 r/min的速度离心5 min，收集细胞沉淀。
29.（3）以107个总细胞加入60
ꢀµ
l缓冲液重悬细胞沉淀。
30.（4）每107个总细胞加入20
ꢀµ
l fcr阻断试剂。
31.（5）每107个总细胞加入20
ꢀµ
l cd133磁珠，充分混匀后在冰箱中（2-8 ℃）孵育15 min。孵育时使用macsmix旋转器缓慢连续旋转以防止细胞沉淀。
32.（6）对孵育好的细胞进行清洗，加入1-2 ml缓冲液洗涤细胞，然后以300 g/min的
速度离心10 min，吸弃上清液。
33.（7）以107个细胞使用500
ꢀµ
l缓冲液吹悬细胞（107个细胞）。
34.（8）将分离柱子（500
ꢀµ
l）放入分离器中，使用润洗液润洗分离柱。
35.（9）将孵育好的细胞缓慢的加入分离柱中，收集未标注的细胞再一次加入分离柱中。
36.（10）用适量缓冲液清洗柱子，重复3次，此步骤为了洗去未标注的细胞（cd133）细胞，使阳性细胞（cd133

）留在分离柱内。
37.（11）从分离架上取下分离柱，把分离柱放在收集管上进行洗脱。
38.5）分选后的细胞成球培养：将磁珠分选后的细胞以1
×
105个细胞/ml接种在肿瘤干细胞培养基中，成球培养的第一代细胞贴壁的较多，收集成球生长的细胞，进行胰酶消化，反复收集成球细胞去除贴壁细胞有利于纯化肿瘤干细胞，经过反复多次传代后获得完全悬浮成球生长的干性细胞。
39.6）肿瘤干细胞鉴定：（1）收集成球的u-118mg干性细胞，经0.05 %胰酶消化，培养基终止，1000 r/min的速度离心5 min，pbs洗涤后重悬计数。
40.（2）将细胞悬液经1000 r/min的速度离心5 min，弃上清。
41.（3）加入4 %多聚甲醛固定液固定15 min后pbs清洗，1000 r/min的速度离心5 min，pbs吹悬制成密度为1
×
106个细胞/ml的细胞悬液。
42.（4）分别加入fitc-cd133，apc-oct4，pe-cd44抗体各2
µ
l（按照美天旎抗体说明书建议比例1:50稀释抗体），室温避光孵育1 h。
43.（5）pbs清洗3次，以去除未结合的cd133，oct4，cd44抗体。
44.（6）细胞重悬于500
ꢀµ
l pbs中，进行流式细胞仪检测，结果如图2所示。
45.7）肿瘤干细胞向u-118mg细胞分化：收集悬浮生长的u-118mg干细胞，将细胞悬液经1000 r/min的速度离心5 min，去除上清，加入适量pbs清洗1次。吸弃pbs并加入0.05 %胰酶置于37℃、5 % co2培养箱中消化5 min。轻轻吹打至单细胞后加入足量pbs稀释胰酶，室温1000 r/min的速度离心5 min，去除上清液，加入适量含血清肿瘤细胞培养液（dmem/f12 10