鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法与流程

function (碳酸氢盐及其在哺乳动物精子功能中的作用),
”ꢀ
anim. reprod. sci. 82: 307-19 (2004))。精子获能期间发生的甾醇类外流改变膜流动性模式并允许重分配特定的膜组分(cohen等人 2014; cross,
ꢀ“
role of cholesterol in sperm capacitation (胆固醇在精子获能中的作用),
”ꢀ
biol reprod. 59: 7-11 (1998); selvaraj等人,
ꢀ“
mechanisms underlying the micron-scale segregation of sterols and g
m1 in live mammalian sperm (甾醇类的微米级分离的潜在机制和活哺乳动物精子中的g
m1
),
”ꢀ
j cell physiol. 218: 522-36 (2007); selvaraj等人,
ꢀ“gm1 dynamics as a marker for membrane changes associated with the process of capacitation in murine and bovine spermatozoa (g
m1
动力学作为与鼠和牛精子中获能过程相关的膜变化的标志),
”ꢀ
j androl. 28: 588-99 (2009))。
6.当前，存在很少的(如果有的话)灵敏且简单的适用于临床应用的获能生物标志。例如，酪氨酸残基的磷酸化已经很好地与获能关联而详细描述(battistone等人,
ꢀ“
functional human sperm capacitation requires both bicarbonate-dependent pka activation and down-regulation of ser/thr phosphatases by src family kinases (有功能的人精子获能需要碳酸氢盐依赖的pka活化和ser/thr磷酸酶被src家族激酶下调二者),
”ꢀ
mol, human reprod. 19: 570-80 (2013); osheroff等人,
ꢀ“
regulation of human sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimulated signal transduction pathway leading to protein kinase a-mediated up-regulation of protein tyrosine phosphorylation (通过胆固醇外流刺激的信号转导途径调节人精子获能导致蛋白激酶a介导的蛋白酪氨酸磷酸化上调),
”ꢀ
mol, human reprod. 5: 1017-26 (1999); visconti等人.
ꢀ“
capacitation of mouse spermatozoa. i. correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation (小鼠精子获能. i. 获能状态与蛋白质酪氨酸磷酸化之间的关联),
”ꢀ
development, 121: 1129-37 (1995))。然而，评估这些事件可耗费数天，并且仅提供半定量评估，使其不适合于临床评估雄性能育性。
7.已经知道一段时间精子必须经历甾醇外流以变得能够受精(osheroff等人 1999; travis等人,
ꢀ“
the role of cholesterol efflux in regulating the fertilization potential of mammalian spermatozoa (胆固醇外流在调节哺乳动物精子的授精能力中的作用),
”ꢀ
the journal of clinical investigation, 110: 731-36 (2002))。另外，胆固醇和其它脂类，例如神经节苷脂g
m1
，在精子质膜内组构成微结构域(asano等人,
ꢀ“
biochemical characterization of membrane fractions in murine sperm: identification of three distinct sub
‐
types of membrane rafts (鼠精子中膜部分的生化表征：鉴定三个不同的膜筏亚型),
”ꢀ
j cell physiol., 218: 537-48 (2009); asano等人,
ꢀ“
characterization of the proteomes associating with three distinct membrane raft sub
‐
types in murine sperm (鼠精子中与三个不同的膜筏亚型相关的蛋白质组的表征),
”ꢀ
proteomics, 10: 3494-505 (2010); travis等人,
ꢀ“
expression and localization of caveolin-1, and the presence of membrane rafts, in mouse and guinea pig spermatozoa (小鼠和豚鼠精子中窖蛋白1的表达和定位，以及膜筏的存在情况),
”ꢀ
dev biol., 240: 599-610 (2001); selvaraj等人 2009)。这些膜筏合并信号传导
通路，使其成为合乎情理的介导精子功能的候选。有趣地，g
m1
定位模式的可预测的变化已经在经刺激获能的小鼠和公牛精子二者中测量到(selvaraj等人 2007)。另外，g
m1
调节r型钙通道的活性，触发顶体胞吐因此成功受精所必需的瞬时钙流(cohen等人 2014)。这些发现证实g
m1
定位模式评估精子功能以及相应地雄性能育性的用途。
8.已经鉴定了各种g
m1
定位模式并与获能或非获能相关。具体地，在牛和人精子中顶端顶体(aa) g
m1
定位模式和顶体质膜(apm) g
m1
定位模式与获能相关。精子获能可定量表述为cap-score
™
值，经由cap-score
™
精子功能检验(“cap-score
™
test”或“cap-score”)产生，定义为([顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目 顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目]/g
m1
标记的定位模式的总数目)，其中测量每一定位模式的数目，然后最终转化为百分比分数。除了apm g
m1
定位模式和aa g
m1
定位模式之外，其它标记的定位模式包括内衬细胞g
m1
定位模式、中间(inter) g
m1
定位模式、顶体后质膜(papm) g
m1
定位模式、顶端顶体/顶体后 (aa/pa) g
m1
定位模式、赤道段(es) g
m1
定位模式和弥散性(diff) g
m1
定位模式(travis等人,“impacts of common semen handling methods on sperm function (常见精液处理方法对精子功能的影响),”the journal of urology, 195 (4), e909 (2016))。
[0009]
发明概述在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞的第一样品用荧光标记处理。获得一个或多个t
0-荧光图像，其中图像显示与t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。t
0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得。对于t
0-荧光图像中显示的t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。确定与测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比相关的能育性状态，其中[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态；比35%低一个标准差指示中等能育性状态；且比35%低两个或更多个标准偏差指示低能育性状态。比较测量的t
0-[aa g
m1
定位模式和apm g
m1
定位模式]的百分比与[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比。生殖途径基于能育性状态鉴定以实现受精。
[0010]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0011]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之
前预先使精子获能、体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0012]
在每一前述实施方案的一个例子中，将体外获能的精子细胞的第二样品用荧光标记处理，其中体外获能的精子细胞的第二样品和体外获能的精子细胞的第一样品与同一雄性相关。获得显示与t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式的一个或多个t
1-荧光图像，其中t
1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1选自大于t0或大于18小时。对于t
1-荧光图像中显示的t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。比较t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或小于12小时的标准体内获能时间。t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。此外当t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t
1-能育性状态基于测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比与[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t
1-能育性状态基于[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比与测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比或测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t
1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0013]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间；改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0014]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t
1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于
t
1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t
1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(icsi), 改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0015]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0016]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0017]
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将t
0-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理和t
1-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个t
0-荧光图像，t
0-荧光图像显示与t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。并且获得一个或多个t
1-荧光图像，t
1-荧光显示与t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。t
0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；t
1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1大于t0。对于t
0-荧光图像中显示的t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。并且对于t
1-荧光图像中显示的t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。比较t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位
模式]的百分比与t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或者12小时或更少的标准体内获能时间。t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比之间的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态，比35%低一个标准差指示中等能育性状态；比35%低两个或更多个标准差指示低能育性状态。此外当t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t
1-能育性状态基于测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比与 [aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t
1-能育性状态基于[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比与测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比或测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t
1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0018]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0019]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t
1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精(ici)之前预先使精子获能或子宫内授精(iui)之前预先使精子获能；(ii) 用于t
1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t
1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(icsi)、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0020]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0021]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0022]
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。产生说明荧光标记处理的体外获能的精子细胞的一种或多种g
m1
定位模式的数据，所述数据在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)，和大于t0的时间(t1)获得。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种g
m1
定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏，并在用获能条件体外处理之前储存。在另一个实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，能育性状态使用在那些时间的一种或多种g
m1
定位模式的数据评估，然后将精子低温贮藏和储存。
[0023]
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。在用获能条件体外处理精子细胞持续不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的cap-score值。比较cap-score值和与已知能育性状态的雄性相关的在那些时间的参考cap-score值。基于cap-score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏并在用获能条件体外处理之前储存。在另一个实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，能育性状态使用在那些时间的一种或多种g
m1
定位模式的数据评估，然后将精子低温贮藏和储存。
[0024]
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。精子细胞用低温贮藏程序处理并用获能条件体外处理不同的时长后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的cap-score值。比较cap-score值与已知能育性状态的
雄性相关的在那些时间的参考cap-score值。基于在那些时间的cap-score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0025]
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。精子细胞用低温贮藏程序处理并用获能条件体外处理不同的时长后，产生说明体外获能的精子细胞的一种或多种g
m1
定位模式的数据。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种g
m1
定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0026]
在另一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当方法的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。测量荧光标记的体外获能的精子样品的cap-score值。比较cap-score值和与能育雄性相关的参考cap-score值。基于cap-score值确定实现成功妊娠的适当机制。
[0027]
附图简述前面的概述，以及下面的发明详述，将会在结合附图阅读时更好地理解。
[0028]
图1a说明平均cap-score在x轴显示且相应的标准差在y轴显示的绘图。对于所有图像，发现平均sd为三(3)，并通过实体水平线显示。虚线显示sd的线性依从性(y = 0.06x 0.02; r= 0.69; p=0.00)。
[0029]
图1b说明平均cap-score在x轴显示且变异系数在y轴显示的绘图。对于所有图像，发现cov为十三(13)，并通过实体水平线显示。虚线显示cov与cap-score平均值的线性依从性(y =
ꢀ‑
0.32x 0.22; r=-0.84; p=0.00)。
[0030]
图2a说明操作者之间平均cap-score的重现性。对于“小于正常”(比正常男性群体的平均cap-score结果低超过一(1)个sd)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定cap-score。
[0031]
图2b说明操作者之间平均cap-score的重现性。对于“假定正常的”(如上分类为比正常男性群体的平均cap-score结果低一(1)个sd)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定cap-score。
[0032]
图3a说明操作者之间cap-score方差的重复性。对于“小于正常”(比正常男性群体的平均cap-score结果低超过一(1)个sd)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定cap-score。
[0033]
图3b说明操作者之间cap-score方差的重复性。对于“假定正常的”(如上分类为比正常男性群体的平均cap-score结果低一(1)个sd)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定cap-score。
[0034]
图4说明正常人精子和来自不育雄性的精子中的各种g
m1
定位模式，其在体外获能条件下形成。
[0035]
发明详述
如本文所描述的，精子获能时期在不同的雄性之间和之内不同。已经发现测定雄性的精子获能时期可用于鉴定授精时期和授精时期期间使用的生殖途径以实现受精。
[0036]gm1
指单唾液酸四己糖基神经节苷脂，为神经节苷脂类的神经节系列的成员。
[0037]
对于人精子，当精子在体外获能条件下时已经报道8种不同的g
m1
定位模式，如图4中所说明的。为了可视化定位模式，将获能的精子用g
m1
的标记分子例如霍乱毒素b (其上具有荧光可检测的标记)处理。
[0038]
inter特征为其中绝大多数荧光信号在赤道段周围的带中以及一些信号在覆盖顶体的质膜中的精子细胞。通常存在荧光信号梯度，大部分在赤道段，然后向顶部逐渐减少。横跨赤道段的带中在精子头部的边缘常常存在荧光信号强度的增加。
[0039]
顶端顶体“aa”特征为其中荧光信号向顶端浓缩、亮度增加且信号区域减少的精子细胞。
[0040]
顶体质膜“apm”特征为在覆盖顶体的质膜显示分布的荧光信号的精子细胞。apm信号从向顶端移动的明亮的赤道inter带见到，或其可起始进一步直至顶端，并且存在于更小的区域，如同其与aa为连续区。
[0041]
顶体后质膜“papm”特征为其中荧光信号只在顶体后质膜中的精子细胞。
[0042]
顶端顶体顶体后“aa/pa”特征为其中荧光信号位于覆盖顶体的质膜和顶体后质膜二者中的精子细胞。赤道段不显示荧光信号。
[0043]
赤道段“es”特征为具有单独位于赤道段的亮荧光信号的精子细胞。其可伴随横跨赤道区域的精子头部增厚。
[0044]
弥散性“diff”特征为具有定位在整个精子头部的弥散性荧光信号的精子细胞。
[0045]
内衬细胞特征为在顶体后区域上面和覆盖顶体的质膜处以及赤道段底部(即，顶体后/赤道带)具有弥散性的荧光信号的精子细胞。荧光信号在赤道段周围缺失。
[0046]
各种g
m1
定位模式通过用g
m1
的标记分子例如霍乱毒素b (其上具有荧光可检测的标记)处理精子细胞鉴定。标记的精子细胞然后使用荧光显微镜可视化，如本领域技术人员所已知的。
[0047]
cap-score定义为[顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目 顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目]除以[g
m1
标记的定位模式的总数目]的比率(travis等人,“impacts of common semen handling methods on sperm function (常见精液处理方法对精子功能的影响),
”ꢀ
the journal of urology, 195 (4), e909 (2016))。为了得出不同g
m1
定位模式的数目，定位模式的数目对于至少100个精子细胞计数。
[0048]
为了本技术的目的，“t
0”对应于用体外获能条件处理精子细胞之后的小时数，其选自0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时。
[0049]
为了本技术的目的，“t
1”对应于用体外获能条件处理精子细胞之后的小时数，其大于18小时或大于t0。
[0050]
为了本技术的目的，图像理解为意指(i) 数字图像；(ii) 操作者通过目镜直接可见的g
m1
模式；或(iii) 通过流式细胞术识别的g
m1
模式。
[0051]
为了本技术的目的，“授精”理解为具有依赖于生殖途径的含义。例如，对于“性交”，授精理解为意指将精子引入雌性的生殖道内。例如，对于“宫颈内授精(ici)”，授精理解为意指将精子引入雌性的宫颈内。对于“子宫内授精(iui)”，授精理解为意指将精子引入
雌性的子宫内。对于“体外受精(ivf)”，授精理解为意指将精子引入包含卵细胞(卵母细胞)的介质的微滴内时，允许共孵育精子和卵细胞。对于“体外受精之前预先使精子获能”，授精理解为意指当将精子引入包含卵细胞(卵母细胞)的介质的微滴内时，允许共孵育精子和卵细胞。对于“胞浆内精子注射(icsi)”，授精理解为意指将精子或预获能的精子注射入卵细胞。对于“配子输卵管内转移(gift)”，授精理解为意指将精子或预获能的精子和卵细胞注射入雌性的输卵管内。对于“透明带下授精(suzi)”，授精理解为意指将单个精子细胞或单个预获能的精子细胞注射入透明带正下方。为了本技术的目的，术语“低温贮藏”指冷冻、储存和为了使用融化细胞的整个过程。
[0052]
如下文所使用的，雄性为哺乳动物。在一个实施方案中，雄性为人。在另一个实施方案中，雄性为非人哺乳动物。在一个这样的实施方案中，雄性为伴侣动物。在另一个实施方案中，雄性为农业动物。在一个这样的实施方案中，雄性为犬科、猫科、马科、牛科、绵羊、山羊、猪、骆驼科或水牛。
[0053]
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞的第一样品用荧光标记处理。获得一个或多个t
0-荧光图像，其中图像显示与t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。t
0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得。对于t
0-荧光图像中显示的t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。确定与测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比相关的能育性状态，其中[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态；低于35%一个标准差指示中等能育性状态；低于35%两个或更多个标准偏差指示低能育性状态。比较测量的t
0-[aa g
m1
定位模式和apm g
m1
定位模式]的百分比与[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比。生殖途径基于能育性状态鉴定以实现受精。
[0054]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0055]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转
移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0056]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的前述实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0057]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于胞浆内精子注射(icsi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0058]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于配子输卵管内转移(gift)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0059]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于透明带下授精(suzi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0060]
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞的第二样品用荧光标记处理，其中体外获能的精子细胞的第二样品和体外获能的精子细胞的第一样品与同一雄性相关。获得显示与t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式的一个或多个t
1-荧光图像，其中t
1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1选自大于t0或大于18小时。对于t
1-荧光图像中显示的t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。比较t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或小于12小时的标准体内获能时间。t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。此外当t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t
1-能育性状态基于测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比与[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t
1-能育性状态基于[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比与测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比或测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t
1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0061]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获
能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0062]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t
1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于t
1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t
1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(icsi)、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0063]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0064]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授
精之前预先使精子获能。
[0065]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的前述实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0066]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于胞浆内精子注射(icsi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0067]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于配子输卵管内转移(gift)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0068]
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于透明带下授精(suzi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0069]
在每一前述实施方案的例子中，鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液ph、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
[0070]
在每一前述实施方案的例子中，一种以上的g
m1
定位模式包括aa g
m1
定位模式、apm g
m1
定位模式、内衬细胞g
m1
定位模式、inter g
m1
定位模式、papm g
m1
定位模式、aa/pa g
m1
定位模式、es g
m1
定位模式和diff g
m1
定位模式。
[0071]
在每一前述实施方案的例子中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
[0072]
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
[0073]
在每一前述实施方案的例子中，精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
[0074]
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将t
0-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理并将t
1-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个t
0-荧光图像，t
0-荧光图像显示与t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。并且获得一个或多个t
1-荧光图像，t
1-荧光显示与t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种g
m1
定位模式。t
0-荧光图像在选自：0.1
小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；t
1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1大于t0。对于t
0-荧光图像中显示的t
0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。并且对于t
1-荧光图像中显示的t
1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目和g
m1
定位模式的总数目，以测定t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比。比较t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或12小时或更少的标准体内获能时间。t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比之间的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态，比35%低一个标准差指示中等能育性状态；并且比35%低两个或更多个标准差指示低能育性状态。此外当t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比与t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t
1-能育性状态基于测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比与[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t
1-能育性状态基于[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]的参考百分比与测量的t
1-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比或测量的t
0-[aa g
m1
定位模式加apm g
m1
定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t
1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
[0075]
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0076]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t
1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精(ici)之前预先使精子获能或子宫内授精(iui)之前预先使精子获能；(ii) 用于t
1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ici)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(iui)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(ivf)时间至晚
期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t
1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(ivf)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(icsi)、改变胞浆内精子注射(icsi)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(gift)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(suzi)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0077]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(ivf)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0078]
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t
1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ici)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(iui)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t
1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(ivf)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(icsi)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(suzi)或透明带下授精之前预先使精子获能。
[0079]
在每一前述实施方案的例子中，鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液ph、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
[0080]
在每一前述实施方案的例子中，一种以上的g
m1
定位模式包括aa g
m1
定位模式、apm g
m1
定位模式、内衬细胞g
m1
定位模式、inter g
m1
定位模式、papm g
m1
定位模式、aa/pa g
m1
定位模式、es g
m1
定位模式和diff g
m1
定位模式。
[0081]
在每一前述实施方案的例子中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
[0082]
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30
小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
[0083]
在每一前述实施方案的例子中，精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
[0084]
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。产生说明荧光标记处理的体外获能的精子细胞的一种或多种g
m1
定位模式的数据，所述数据在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)，和大于t0的时间(t1)获得。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种g
m1
定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏，并在用获能条件体外处理之前储存。
[0085]
在一个这样的实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。在一个实施方案中，获能条件包括体外暴露于2-羟丙基-β-环糊精。在另一个实施方案中，非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精，持续不同的时期。
[0086]
在一个这样的实施方案中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。在一个实施方案中，固定剂包括多聚甲醛或戊二醛。
[0087]
在前述实施方案的例子中，雄性的能育性状态数据通过比较说明体外获能的精子细胞的g
m1
定位模式的数据与说明具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子细胞的g
m1
定位模式的参考数据表征。在一个这样的实施方案中，对于预定数目的体外获能的精子细胞，测定每一g
m1
标记的定位模式的数目。然后计算顶端顶体(aa) g
m1
定位模式的数目和顶体质膜(apm) g
m1
定位模式的数目的总和与g
m1
标记的定位模式的总数目的总和的比率。然后比较g
m1
定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的g
m1
定位模式的参考比率。在这样的实施方案中，一种以上的g
m1
定位模式对应于顶端顶体(aa) g
m1
定位模式、顶体质膜(apm) g
m1
定位模式、内衬细胞g
m1
定位模式、中间(inter) g
m1
定位模式、顶体后质膜(papm) g
m1
定位模式、顶端顶体/顶体后 (aa/pa) g
m1
定位模式、赤道段(es) g
m1
定位模式和弥散性(diff) g
m1
定位模式。
[0088]
在前述实施方案的另一个例子中，比较雄性的能育性状态数据和与已知授精时期相关的以及与已知生殖途径相关的已知男性能育性状态的数据。在这样的实施方案中，已知的能育性状态包括能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
[0089]
在前述实施方案中，生殖途径可对应于自然授精途径和人工授精途径，如本领域所已知的。在一个实施方案中，生殖途径包括：性交、宫颈内授精(ici)、子宫内授精(iui)、体外受精(ivf)、胞浆内精子注射(icsi)、体外受精之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)和透明带下授精(suzi)。
[0090]
对于其中生殖途径对应于性交的实施方案，性交的时期相对于雌性的排卵时间确
定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
[0091]
对于其中生殖途径对应于ici或iui的实施方案，授精时期相对于雌性的排卵时期确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
[0092]
对于其中生殖途径对应于ivf的实施方案，授精时期对应于确定前核形成之前3小时、确定前核形成之前4小时、确定前核形成之前6小时、确定前核形成之前12小时、确定前核形成之前18小时、确定前核形成之前24小时或确定前核形成之前30小时。
[0093]
对于其中生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0094]
对于其中生殖途径对应于胞浆内精子注射(icsi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0095]
对于其中生殖途径对应于配子输卵管内转移(gift)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0096]
对于其中生殖途径对应于透明带下授精(suzi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0097]
在前述实施方案的一些例子中，其它参数可用于鉴定授精时期和生殖途径。其它参数可包括下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液ph、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
[0098]
在另一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。在用获能条件体外处理精子细胞不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的cap-score值。比较cap-score值和与已知能育性状态的雄性相关的在那些时间的参考cap-score值。基于cap-score值，鉴定使用的授精时期和生殖途径以实现受精。
[0099]
在一个这样的实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
在另一个实施方案中，非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精持续不同的时期。
[0100]
在一个其它的这样的实施方案中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。在一个实施方案中，固定剂包括多聚甲醛或戊二醛。
[0101]
在前述实施方案的一个例子中，比较cap-score值和与已知授精时期相关的以及与已知生殖途径相关的已知男性能育性状态的参考cap-score值。在这样的实施方案中，已知的能育性状态包括：能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
[0102]
在前述实施方案的例子中，cap-score对应于aa g
m1
定位模式的数目和apm g
m1
定位模式的数目的总和与g
m1
标记的定位模式的总数目的总和的比率，其每一对于体外获能的精子样品测定。在这样的实施方案中，一种或多种g
m1
标记的定位模式包括aa g
m1
定位模式、apm g
m1
定位模式、内衬细胞g
m1
定位模式、inter g
m1
定位模式、papm g
m1
定位模式、aa/pa g
m1
定位模式、es g
m1
定位模式和diff g
m1
定位模式。
[0103]
在前述实施方案中，生殖途径可对应于自然授精途径和人工授精途径，如本领域所已知的。在一个实施方案中，生殖途径包括：性交、宫颈内授精(ici)、子宫内授精(iui)、体外受精(ivf)、胞浆内精子注射(icsi)、体外受精之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(gift)和透明带下授精(suzi)。
[0104]
对于其中生殖途径对应于性交的实施方案，性交的时期相对于雌性的排卵时间确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
[0105]
对于其中生殖途径对应于ici或iui的实施方案，授精时期相对于雌性的排卵时期确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
[0106]
对于其中生殖途径对应于ivf的实施方案，授精时期对应于确定前核形成之前3小时、确定前核形成之前4小时、确定前核形成之前6小时、确定前核形成之前12小时、确定前核形成之前18小时、确定前核形成之前24小时或确定前核形成之前30小时。
[0107]
对于其中生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0108]
对于其中生殖途径对应于胞浆内精子注射(icsi)的实施方案，授精之前预获能的
时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0109]
对于其中生殖途径对应于配子输卵管内转移(“gift”)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0110]
对于其中生殖途径对应于透明带下授精(suzi)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
[0111]
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当机制的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。将精子细胞用获能条件体外处理不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的cap-score值。比较cap-score值和与能育雄性相关的参考cap-score值。基于cap-score值确定实现成功妊娠的适当机制。在一个实施方案中，确定还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液ph、精液粘度和/或精子形态学。
[0112]
在任何前述实施方案的例子中，精液样品使用具有足够直径尺寸的孔口的宽口吸管处理以防止剪切精子膜，并且精液样品不使用可损伤精子膜的试剂处理。在一个这样的实施方案中，将处理的精液样品暴露于获能介质、固定剂和用于测定g
m1
定位模式的试剂。
[0113]
在一个实施方案中，可损伤精子膜的试剂选自：(i) 蛋白酶；(ii) 核酸酶；(iii) 溶粘蛋白剂；(iv) 脂肪酶；(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。可类似地干扰精子响应获能刺激物的能力的化合物的实例包括：(i) 蛋白酶，包括但不限于，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶；(ii) 核酸酶，包括但不限于，链道酶、hindiii、ecori；(iii) 溶粘蛋白剂，包括但不限于，厄多司坦(erdostein)、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚(guiafenesin)；(iv) 脂肪酶，包括但不限于，磷脂酶a1、磷脂酶c、脂蛋白脂肪酶；(v) 酯酶，包括但不限于，胆碱酯酶、硫酯酶、碱性磷酸酶；和(vi) 糖苷水解酶类，包括但不限于，α淀粉酶、β半乳糖苷酶、透明质酸酶、神经氨酸酶(neuorminodase)和溶菌酶。
[0114]
在任何前述实施方案的例子中，测定一种或多种g
m1
标记的定位模式的群体大小，以致于关于cap-score的百分比变化在个体内最小化。在一些这样的实施方案中，一种或多种g
m1
标记的定位模式包括aa g
m1
定位模式、apm g
m1
定位模式、内衬细胞g
m1
定位模式、中间(inter) g
m1
定位模式、顶体后质膜(papm) g
m1
定位模式、顶端顶体/顶体后 (aa/pa) g
m1
定位模式、赤道段(es) g
m1
定位模式和弥散性(diff) g
m1
定位模式。
实施例
[0115]
下列实施例进一步描述和证明本发明范围内的说明性实施方案。实施例仅为了说明给出，不应解释为对本发明的限制，因为不脱离其精神和范围时的许多变更是可能的。
[0116]
实施例1
精子操作方法评估了三种减少粘度的常见方法。将射精液：1) 孵育0.25、1.25或2小时，2) 用改良的人输卵管液(irvine scientific; santa anna, ca) 1:1稀释，然后通过宽口移液管(“wotp”)或巴斯德吸管(“pp”)，3) 用糜蛋白酶(“chymo”)酶促消化。初步研究显示通过皮下针头负面影响能动性和膜完整性并且未进一步研究。液化后，将样品洗涤并在获能(cap)和非获能(nc)条件下孵育。cap-score值通过荧光显微术按照上述计算获得。
[0117]
cap-score
™
的可靠性和重现性将来自同意的男性的精液样品液化之后，将精子洗涤、孵育、固定，然后通过荧光显微术评估g
m1
定位模式。对一个样品内评分的精确度和读取者之间评分同一样品的变异二者均进行评估。使用microsoft excel (2013)进行利用不等方差的student's t检验。
[0118]
cap-score与传统精液分析参数的相关性将来自同意的患者的精液样品液化、洗涤并在非获能和获能两种条件下孵育。精液分析根据who指南进行。cap-score值通过荧光显微术获得。统计分析使用microsoft excel (2013)和xlstat (2015)进行。
[0119]
对于已证明能育性的雄性与待评估能育性的雄性使用cap-score
™
评估获能测定来自两个组的同意男性的cap-score值：1) 已知能育性(怀孕的伴侣或为小于3岁的儿童的父亲)，和2) 寻求其第一次精液分析的患者。液化之后，将精子洗涤并将3百万在非获能(nc)和获能(cap)条件下孵育3小时。将精子固定过夜并通过荧光显微术评估g
m1
定位模式。
[0120]
结果液化时间、稀释和吸液不改变cap-score值。对照(仅孵育)、wotp和pp处理的样品具有cap-score值41
±
4、40
±
5和41
±
6 (n=5; cap)。对获能刺激物的响应的降低在样品使用chymo液化时观察到(p=0.03)。对照样品具有cap-score值40
±
6 (n=5; cap)，而酶促液化的样品具有cap-score值31
±
4 (n=5; cap)。由于chymo为可切割膜蛋白的蛋白酶，因此进行检查以确定减少的cap-score值是否由标记的变更引起。比较未暴露于获能刺激物的样品，未观察到差异。对照和酶促液化的样品具有cap-score值22
±
4和21
±
5 (n=5; nc)。这些数据支持以下观点：用chymo处理精液(尽管在临床实践中广泛使用)可抑制精子响应获能刺激物的能力。
[0121]
可类似地干扰精子响应获能刺激物的能力的化合物的类别包括：(i) 蛋白酶，包括但不限于，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶；(ii) 核酸酶，包括但不限于，链道酶、hindiii、ecori；(iii) 溶粘蛋白剂，包括但不限于，厄多司坦(erdostein)、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚(guiafenesin)；(iv) 脂肪酶，包括但不限于，磷脂酶a1、磷脂酶c、脂蛋白脂肪酶；(v) 酯酶，包括但不限于，胆碱酯酶、硫酯酶、碱性磷酸酶；和(vi) 糖苷水解酶类，包括但不限于，α淀粉酶、β半乳糖苷酶、透明质酸酶、神经氨酸酶(neuorminodase)和溶菌酶。
[0122]
多达2小时的液化时间和使用wotp和/或pp机械液化不影响获能。相反，使用酶例如chymo减少精子获能的能力，如通过cap-score
™
检验所测量的。这些结果证明知道精液处理方法如何影响精子功能的重要性。
[0123]
精确度通过比较当评估50、100、150和200个精子时cap-score值的百分比变化(%
δ=(y
2-y1)/y2)评估。对于每一次加入50个精子，观察到11、6和5%的值变化(n≥23)。为保守起见，cap-score值通过计数至少150个细胞的g
m1
定位模式测定。为了评估读取者内和之间的变异，8个包含多达5,000个精子的大图像文件通过组合从多个视野获取的图像产生。训练两个不同的读取者，其通过随机重新取样每一图像20次、每次计数150个细胞测定cap-score值。当评分同一样品时，个体读取者报告三(3)个cap-score单元的平均sd。当评分同一样品时读取者之间的差异在0.00-1.52范围内，对于任何给定样品读取者之间的平均差异为一(1)。对于多重比较应用bonferroni校正，对于任何图像文件，读取者之间未观察到差异(p-值范围0.02-0.99)。
[0124]
cap-score不受液化时间或用wotp或pp机械液化影响(n=5)，尽管洗涤和孵育后，经历两(2)小时液化或通过pp后的样品显示更大的能动性下降(p=0.02, 3e-3)。使用针头损伤精子，并且未进一步调查。用chymo液化减少cap的cap-score (p=0.03)，但nc样品不减少(p=0.74)。用chymo孵育的样品(n=5; 3mg/ml)由于膜损伤不能评分，但在nc条件下显示能动性增加(p=9e-4)。
[0125]
实施例2本实施例使用能育(组1，怀孕或新近的父亲)和潜在的低能育性/不育男性(组2，怀疑能育性的男性)之间的组比较进行。还探究cap-score与传统精液量度之间的关系。
[0126]
所有研究由wirb (20152233)批准。将精液样品液化、洗涤和在非获能以及获能条件下孵育。将精子固定过夜，cap-score通过荧光显微术测定。精液质量量度根据who评估。t-检验、anova和相关性分析使用microsoft excel (2013)和xlstat进行。
[0127]
组1的平均cap-score为35.3 (sd= 7.7%; n=76个供体; 187个收集)。cap-score对于组2较低(p=1.0e-03)，33.6% (41/122)具有比组1的平均值低一(1)个sd以下的cap-score，相对于预期的16%。对于组2，cao-score和形态学(p=0.28)、能动性(p=0.14)或浓度(p=0.67)之间未观察到相关性。组2中93.4% (114/122)的男性显示正常能动性，而其中的30.7% (35/114)具有比平均值低一(1)个sd以下的cap-score。类似地，122个男性中的101个(82.7%)显示正常浓度，而32.6% (33/101)具有比平均值低一(1)个sd以下的cap-score。这些结果显示获能缺陷在受孕困难的男性中常见，cap-score提供补充精液分析的功能数据。
[0128]
精子获能的能力在能育男性和受孕困难的那些之间不同。由于获能是受精所需的，因此cap-score可提供标准精液分析的重要功能补充，并且可帮助选择最适合的能育性治疗。
[0129]
精液质量的常见量度是主观的，可在读取者之内和之中变动，使雄性能育性的评估富有挑战。cap-score
™
检验评估精子获能的能力，其为雄性能育性所必需的。本文呈现的数据显示cap-score
™
检验在读取者之内和之间是高度可重现和可靠的，当企图诊断雄性不育时这是关键考虑。
[0130]
使用来自41个能育男性的cap-score均值(
µ
=39)和sd (σ=7)估计建立稳健的能育的获能概况所需的已知能育男性的数目。对于功效分析，均值的可接受范围设置为3%，双尾t检验设置为p《0.01水平，且应用检测如此大的差异的概率为90%。结果提示有效标准可用≥85个个体建立。初步的正常可育标准使用来自41个独特供体的125个观察值建立。cap-score值按供体平均，然后转换为z-分数((x-μ)/σ; x=观察值,
ꢀµ
=39; σ=7)。这将
µ
转换为
0，σ转换为1，转换值代表距
µꢀ
(均值)以σ (s.d.)为单位的距离。正常的能育标准针对来自寻求能育性检查的93个男性的cap-score值检验。该组评分显著低于能育的群体(p=1.6e-5)，27和38%具有z-分数≤-2和在-1与-2之间。仅35%得分在均值附近或以上。这些数据提示，与能育男性相比，许多寻求能育性检查的男性具有获能缺陷。
[0131]
实施例3实施例1和2中使用的程序在实施例3中使用。
[0132]
经典的精液分析提供关于样品使卵受精的能力的很少信息。获能为受精所需，并且可使用g
m1
定位评估。来自两个男性组的cap-score值的比较显示其获能能力的显著差异。稳健的获能概况可定义并用于鉴定异常。显著地，33%的怀疑其能育性的男性具有z-分数≤-1，相对于期望的结果16%。组合cap-score
™
检验与传统分析在诊断男性不育中证明是有价值的。
[0133]
分析来自求助于不育专家的122个男性的样品，其cap-score在13-52%范围内。进行方差分析以比较cap-score值与精子形态学。将样品分类为具有0、1、2、3或≥ 4%正常形式(分数≥ 4%认为正常，who)，并比较组之间的平均cap-score。cap-score值和形态学之间未观察到相关性(p=0.67)。接着，使用皮尔逊积矩相关系数比较精子浓度(范围3x106ꢀ‑ꢀ
210x106/ml)与cap-score值，未发现联系(r=0.01, p=0.90)。最后，比较cap-score值与总%能动性(范围15-80%)，两个量度确定为独立的(r=0.14 p=0.21)。按照who标准分类为正常的多个供体具有cap-score值低于正常均值超过两(2)个sd，支持以下观点：即使正常外观的精子仍可具有功能异常。
[0134]
传统精液分析仅鉴定50%的雄性不育病例。本研究显示cap-score值与标准精液分析参数之间几乎无相关性。由于获能是受精所必需的，将cap-score检验加入传统精液评估能够鉴定特发性不育病例，并且帮助临床医生为夫妻建议最适当的治疗。
[0135]
本文呈现的数据证明雄性的cap-score值可提供用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当机制的指南，包括推荐的辅助生殖技术例如体外受精(ivf)或胞浆内精子注射(icsi)。雄性可为人或非人哺乳动物。可考虑cap-score值组合精液分析的其它组分，包括浓度、总能动性、前进能动性、体积、ph、粘度和/或形态学。例如，对于具有相同cap-score的两个雄性，如果其精子计数或精子能动性不同，推荐的辅助生殖技术可能不同。另外，雌性伴侣的能育性状态或生殖健康也会被临床医生考虑。
[0136]
实施例4将来自同意的男性的精液样品液化、洗涤，将等分试样在非获能(nc)或获能(cap)条件下孵育。同意的男性包括基于怀孕伴侣或为新近的生物学父亲的雄性而分类为能育的男性。同意的男性还包括寻求能育性检查的男性。获能条件包括体外暴露于2-羟丙基-β-环糊精。非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精持续不同的时期。然后将体外获能的精子和体外非获能的精子在固定剂例如多聚甲醛或戊二醛中固定。然后将固定的体外获能的精子和体外非获能的精子用荧光标记的霍乱毒素b亚基标记。
[0137]
对于一个数据集，将精子样品在获能或非获能条件中孵育三(3)个小时、固定、标记，然后分析(“第0天”)。对于第二个数据集，将精子样品在获能或非获能条件中孵育三(3)个小时、固定过夜、标记，然后分析(“第1天”)。对于第三个数据集，将精子样品在获能或非
irvine scientific; 参考90126)中，在600xg沉淀10分钟。将精子重悬在具有和不具获能刺激物的mhtf中，孵育三(3)小时。孵育之后，将样品在标记之前如所描述的(selvaraj v,等人,
ꢀ“
segregation of micron
‐
scale membrane sub
‐
domains in live murine sperm (活鼠精子中微米级膜亚结构域的分离),
”ꢀ
j cell physiol. 206: 636-46 (2006))用多聚甲醛(electron microscopy sciences; hatfield, pa)固定至少30分钟。
[0146]
将样品用2
ꢀµ
g/ml缀合alexa fluor 488 (ctb; thermo fisher: c34775)的霍乱毒素b标记。10分钟之后，将5
ꢀµ
l标记的精子放在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖并移动至成像台。
[0147]
成像台由nikon eclipse ni-e显微镜组成，配备有：cfi60 plan apochromat lambda 40x物镜, c-fl at gfp/fitc长通滤波器组, hamamatsu orca-flash 4.0照相机, h101f
ꢀ‑ꢀ
proscan iii open frame upright motorized h101f flat top显微镜载物台和运行nis elements软件(nikon; melville, ny)的64位成像工作台。这些系统编程为自动捕获包含多达5,000个精子的15x15拼接图像组。
[0148]
cap-score sft检测和分析神经节苷脂g
m1
的定位模式。训练两个独立的读取者以鉴定与人精子获能相关的g
m1
定位模式。测定样品内经历获能的精子的比例并报告为cap-score。
[0149]
功效分析使用g*power (faul等人,
ꢀ“
g* power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences (g* power 3：用于社会、行为和生物医学科学的灵活的统计功效分析),
”ꢀ
behav res methods. 39: 175-91 (2007))进行。student's t-检验使用microsoft excel (2013)进行。线性回归和同方差性bartlett's检验在xlstat 版本2015.5.01.22912中进行。
[0150]
结果测定cap-score精确度的第一步是为了定义每样品计数的细胞数目。一般而言，随着计数的细胞数目的增加，精确度增加。然而，在一些点，计数额外的细胞变得冗余，因为cap-score将不会随额外的观察增加。为了鉴定计数额外的细胞不必要的点，评估当50、100、150和200个精子时cap-score的百分比变化(表1)。
[0151]
表1：随着计数的精子数目的增加cap-score的百分比变化与当计数100或150个以及150或200个精子时的百分比变化相比，当计数50或100个精子时cap-score的百分比变化较大。这些观察结果支持以下观点：cap-score精确度通过计数超过100个精子仅适度改善。然而，当计数50或100以及150或200时百分比变化的95%
置信区间不重叠，提示当计数至少150个细胞时百分比变化的显著减少。为保守起见，cap-score通过计数至少150个细胞的g
m1
定位模式测定。
[0152]
为了进一步探究cap-score可靠性和评估其作为精液质量的客观量度的潜能，调查其测量值以确定其在个体读取者内的准确度。准确度定义为测量值与真实值的接近程度。未知群体的真实值可通过其集中趋势或均值估计。可基于其分散性或精确度的倒数判断一个数据集是否具有强或弱集中趋势(jcgm/wg2 2008)。即随着分散性增加，精确度降低。标准差(sd)和变异系数(cov)测量样品内分散性的量。接近零(0)的标准差表明数据点倾向于紧密聚集在均值，而高标准差指示数据点散开。类似地，cov代表分散性相对于均值的量(cov=sd/均值)，其可用于比较一个数据系列与另一个的变异程度，即使彼此均值大不相同。
[0153]
评估读取者内的cap-score准确度之前，估计每一读取者取样的图像数目。为此，两个精液供体组基于比具有假定能育性的男性群体(怀孕的妻子或小于3岁的儿童)的平均cap-score低(一）个sd的截断定义。具有“较低cap-score”的组的平均cap-score为27，而“假定能育的”组为40。每组的标准差分别为5.2和4.9。使用双尾检验的功效分析以p《0.05和p《0.01水平进行，如果存在，检测如此大差异的概率为90% (1
−
beta=0.90)。这些分析的结果表明样品10和14个图像(每组5和7)应分别取样。为保守起见，产生各自在“较低cap-score”和“假定能育”组的10个图像。每组取样该数目的图像确保各自被充分审查以鉴定重现性的任何差异，其由于低或高值cap-score可能发生。
[0154]
为了评估cap-score sft的准确度，两个不同的读取者通过从“低cap-score”和“假定能育”组随机重新取样10个图像(每一包含多达5,000个精子)测定cap-score，并且每一读取者重新取样20次。sd和cov在每一图像基础上对于每一读取者计算。图像和读取者中的平均sd为3 (图1a)，平均cov为13% (图1b)。sd和cov二者均显示与cap-score的线性关系。因此，尽管存在与读出较高cap-score相关的较大分散性，这显示是由较大的cap-score量值引起。这些数据符合高程度的准确度，因为当同一精子群体由同一或不同读取者随机重新取样时，cap-score值紧密聚集在真实值。由于这些方差和(或)分散性的量度小并且稳定，其显示读取者内高程度的cap-score重现性。
[0155]
一般而言，分布可使用其均值和方差描述。均值指示分布的位置，而方差描述数据的分散程度。可设想两种分布，其均值相同，而方差不同。例如，一种分布可能类似于标准的钟型，而另一种更扁平，具有更多极值。为了证明读取者之间相似的cap-score分布，对于“低cap-score”和“假定可育”组的每一个，获得10个拼接图像。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次确定cap-score。由于每一图像文件包含比所取样的多几个量级的精子，每一次随机重新取样代表来自个体射精液内不同的细胞子样品。
[0156]
对于20个不同的图像，读取者之间观察到平均cap-score的平均差异为一(1) (图3)。当应用bonferroni校正时，未观察到可辨别的差异。类似地，cap-score方差在读取者之间无差异(图3)。这些数据支持以下观点：cap-score在读取者之间可重现，因为当重新取样同一精子群体时独立的读取者获得相似的cap-score分布。总之，这些数据提供强烈的证据，表明cap-score sft在读取者内和之间高度可重现和可靠，这在试图评估雄性生殖适合度时为关键考虑。
[0157]
当前研究中呈现的数据证明cap-score sft在读取者内和之间高度可重现和可
靠。获得的数据和图像文件应用作实验室内部和之间在评估cap-score中的连续质量控制(qc)和质量保证(qa)的基础。例如，20个图像文件中的两个，“低cap-score”和“假定可育”组各一个，可随机选择并每天评分以证明读取者每日读取cap-score的能力。如果获得距建立的均值超出可接受的范围(westgard等人,
ꢀ“
a multi-rule shewhart chart for quality control in clinical chemistry (用于临床化学中质量控制的多规则shewhart图表),
”ꢀ
clin chem. 27: 493-50 (1981)的值，可请教实验室主任以补救。这些数据也可用于随时间追踪个体读取者和鉴定cap-score测定的潜在变化。类似地，随着新人员和(或)实验室受训练和合并入读取轮换，其读取能力可通过评分多个图像文件和比较其cap-score与建立的值评估。这种方法将确保实验室内和之间相当的数据。只有通过持续的内部和外部qa和qc，才能维持高标准的精子功能评估。
[0158]
雄性能育性诊断过去受到不能评估精子功能，即受精的能力困扰(oehninger等人,
ꢀ“
sperm functional tests, (精子功能检验)
”ꢀ
fertil steril. 102: 1528-33 (2014); wang等人,
ꢀ“
limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests (精液分析作为雄性能育性检验的限制和对新检验的预期需求),
”ꢀ
fertil steril. 102: 1502-07 (2014))。这种诊断能力将为传统精液评估的描述性评估提供功能补充。鉴定具有受精能力缺陷的精子可允许更特异性地诊断现在分类为特应性不育的那些。更大的实践重要性是，该信息可使得临床医生能够帮助为夫妻建议最合适的art形式以实现妊娠。为了实现先前指定的目标，已经建议了许多精子功能测定(例如，仓鼠透明带穿透测定(barros等人,
ꢀ“
human sperm penetration into zona
‐
free hamster oocytes as a test to evaluate the sperm fertilizing ability (人精子穿透入无透明带的仓鼠卵母细胞作为评估精子受精能力的检验),
”ꢀ
andrologia. 11: 197-210 (1979); rogers等人,
ꢀ“
analysis of human spermatozoal fertilizing ability using zona-free ova (使用无透明带的卵子分析人精子的受精能力),
”ꢀ
fertil steril. 32: 664-70 )1979)、精子-zp结合检验(liu等人,
ꢀ“
clinical application of sperm-oocyte interaction tests in in vitro fertilization
–
embryo transfer and intracytoplasmic sperm injection programs (精子-卵母细胞相互作用检验在体外受精中的临床应用—胚胎转移和胞浆内精子注射程序),
”ꢀ
fertil steril. 82: 1251-63 (2004)和宫颈粘液穿透测定(alexander,
ꢀ“
evaluation of male infertility with an in vitro cervical mucus penetration test (用体外宫颈粘液穿透检验评估雄性的不育性),
”ꢀ
fertil steril. 36: 201-8 (1981); menge等人,
ꢀ“
interrelationships among semen characteristics, antisperm antibodies, and cervical mucus penetration assays in infertile human couples (精液特征、抗精子抗体和宫颈粘液穿透测定在不育的人类夫妻中的相互关系).
”ꢀ
fertil steril. 51: 486-92 (1989); eggert-kruse等人,
ꢀ“
prognostic value of in vitro sperm penetration into hormonally standardized human cervical mucus (体外精子穿透入激素标准化的人宫颈粘液的预后价值),
”ꢀ
fertil steril. 51: 317-23 (1989)。然而，其使用受到很难以逻辑上实用的方式获得需要的材料限制。为了填充当前的空白，开发了诊断工具以评估精子经历使卵母细胞受精所需的生理学变化的能力。
[0159]
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