一种谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建其应用

1.本发明涉及微生物学领域，特别是工程菌株的改造例如底盘构造领域，具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建其应用。


背景技术：

2.谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是一种严格好氧的、高gc含量的典型棒状杆菌。最早是在1957年由日本学者从土壤中分离得到，而后逐渐成为了一种重要的工业菌种，也是近五十来全球用以氨基酸发酵工业的主要生产菌。除了被用于生产多种氨基酸外，还被用于生产醇类、芳香族类、萜类、二胺类等多种产品，在医药、农业、工业中均有广泛的应用。
3.插入序列(insertion sequences,is)是一类存在于细胞内的可移动遗传元件，广泛分布在细菌的基因组和质粒中，在哺乳动物细胞中也有一定分布。其能够自发的移动，从而使基因组发生缺失、重复或倒位等dna重排现象。目前已鉴定分离出的插入序列元件有26个家族，分别分布在不同的细菌中并存在不同数量的拷贝，以相同或不同的转座机制在基因组内或基因组之间进行水平移动。同时插入序列元件也可作为其它移动遗传因子，如原噬菌体的一部分进行转移。
4.在目前的氨基酸发酵工业和重组蛋白生产中，常常遇到菌种退化的问题。因为可移动元件在遗传过程中的非目的性的转座引起的遗传异质性是菌种退化的一个重要原因。多数工业菌株中存在的细菌插入序列元件会破坏生产基因或操纵子，从而破坏代谢调控或者蛋白的生产表达。已有研究表明，在大肠杆菌中，无is元件的宿主传播生物合成途径和蛋白质编码基因更稳定。
5.优良菌株的获得需要进行代谢工程、基因工程等改造，而减少菌株退化、维持菌株良好性状是十分重要的。删除谷氨酸棒状杆菌中的插入序列元件是稳定菌株生产的一种有效策略。此外，谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除株也可作为出发菌株进行代谢改造，其能够最大限度降低插入序列元件对代谢改造带来的影响。


技术实现要素：

6.为了现有菌株存在的缺点和不足，本发明的目的是获得一种谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变菌株，具有更稳定的生物合成途径和蛋白编码。
7.本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变菌株的构建方法，所述谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变菌株指的是在谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分敲除插入序列元件。
8.优选地，出发菌株为谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株。
9.本发明所述的插入序列元件，包括isl3、is30、is6、is3、is1380以及is transposase家族的插入序列基因。
10.优选地，所述插入序列元件选择的条件是其基因长度大于500bp以上。
11.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
12.一种谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，所述菌株缺失1个或多个插入序列元件。
13.进一步地，所述的序列元件，选自isl3、is30、is6、is3、is1380以及is transposase家族的基因。
14.进一步地，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分isl3家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is30家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is6家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is3家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is1380家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is transposase家族基因；所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分敲除插入序列元件。
15.在本发明的具体实施方案中，通过一轮同源重组和一轮特异性位点重组实现单个is元件的删除，进而构建is元件删除突变菌株。
16.在本发明的具体实施方案中，通过在bhis和cgxⅱ培养基中进行生长测试，确定构建的is元件删除突变菌株isdm029具有低碳源下的生长优势。
17.在本发明的具体实施方案中，通过电转化荧光表达质粒和电转人工dna片段，确定构建的is元件删除突变菌株在电转效率和重组效率上的提高。
18.在本发明的具体实施方案中，通过荧光表达质粒的表达水平，确定构建的is元件删除突变菌株在外源蛋白表达量的提高。
19.在本发明的具体实施方案中，通过对含荧光表达质粒的is元件删除突变菌株进行传代实验，确定构建的is元件删除突变菌株isdm029在外源蛋白表达的稳定性提高、异质性的减少。
20.在本发明的具体实施方案中，通过紫色杆菌素在不同代数的表达水平，确定构建的is元件删除突变菌株isdm029对外源代谢产物的表达量提高和稳定性提高。
21.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
22.首先经改造后的谷氨酸棒状杆菌的菌种基因组更稳定，菌种更不容易退化；其次遗传转化效率更高；外源蛋白和外源代谢产物表达量都更高，更稳定。
附图说明
23.图1为实施例中质粒载体pxmj19-recet的示意图；
24.图2为实施例中iscg21敲除组件及表达盒电泳图。包括iscg21基因上游同源臂iscg21-u，iscg21基因下游同源臂iscg21-d，“上游同源臂-lox71-arac-p
bad-cre表达盒”和“kanr-lox66-下游同源臂”以及融合片段“上游同源臂-lox71-arac-p
bad-cre-kanr-lox66-下游同源臂”的iscg21基因敲除表达盒iscg21-cassette。
25.图3为电转化iscg21敲除表达盒替换菌株和敲除菌株的菌落pcr鉴定电泳图及测序结果。a)iscg21基因替换菌落pcr鉴定。泳道m：dl 5,000 dna marker；泳道1～16：单克隆1～16，预期条带大小为4,958bp；泳道nc：野生型谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株，预期条带大小为3,123bp。b)iscg21基因敲除菌落pcr鉴定。泳道m：dl 5,000 dna marker；泳道1～16：单克隆1～16，预期条带大小为1,789bp；泳道nc：野生型菌株，预期条带大小为3,123bp。
c)野生型、重组菌株及删除突变菌株pcr示意图。d)删除突变菌株的测序结果比对。
26.图4为is元件删除突变株与野生型菌株在bhis中生长曲线。
27.图5为is元件删除突变株与野生型菌株在cgxⅱ中生长曲线。
28.图6为实施例中谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变株电转效率分析结果图。
29.图7为实施例中谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变株sfgfp表达量情况。
30.图8a为实施例中谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变株sfgfp表达的流式细胞技术分析结果图。
31.图8b为实施例中谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变株sfgfp表达的流式细胞技术分析结果图。
32.图9为实施例中谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变株isdm029表达的紫色杆菌素的分析结果图。
具体实施方式
33.以下结合实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
34.实施例1
35.recet重组质粒表达的谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备
36.1.质粒载体pxmj19-recet的构建
37.pxmj19质粒(genebank：aj133195.1)为e.coli-c.glutamicum穿梭载体。
38.以pxmj19为模板，p1/p2为引物，pcr扩增得到片段1(pxmj19质粒骨架部分)；以pxmj19为模板，p3/p4为引物，pcr扩增得到片段2(pxmj19质粒骨架部分)；以大肠杆菌mg1655基因组为模板，p5/p6为引物，pcr扩增得到片段3(recet基因)。将片段1,2,3进行gibson组装，得到pxmj19-recet质粒。
39.p1:aattcagcctggcggtgtaatgggtctccccatgcgagagtag
40.p2:agtacgcagtcttaatacccgcttca
41.p3:agcgggtattaagactgcgtactct
42.p4:caggaagagtggttttgtgctcattcggtacccggggatcctct
43.p5:atgagcacaaaaccactcttcctg
44.p6:cattacaccgccaggctgaatt
45.图1中的ori为复制起始位点；
46.pbl1(ori)；谷氨酸棒状杆菌的pbl1复制子；
47.cmr：氯霉素抗性基因；
48.laciq promoter/lac operator：阻遏蛋白laciq基因启动子、lac操纵基因
49.p
tac promoter：谷氨酸棒状杆菌的p
tac
启动子
50.rece/rect：噬菌体的核酸外切酶基因和单链退火蛋白基因
51.rrnb t1/t2 terminator：大肠杆菌rrnb基因的转录终止子t1/t2；
52.2.recet重组质粒表达的谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备
25.0ml，2.5mm dntps 10.0μl，引物1μl(引物浓度10mm)，基因组dna 200.0ng，kod dna polymerase 1.0μl，ddh2o补齐至50μl。其中pcr反应的条件包括：94℃预变性5min，98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1kb/min，变性退火和延伸过程循环30次，最后68℃延伸5min。得到扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段(图2，其中，泳道m1：dl 2,000 dna marker；泳道m2：dl 5,000 dna marker；泳道1～7：f-uha21，f-dha21，f-p
bad-cre，f-kanr，f-uha21-lox71-p
bad-cre，f-kan
r-lox66-dha21，f-iscg21。)。基因iscg21上游同源臂iscg21-uha长度为823bp，下游同源臂iscg21-dha长度为840bp，arac-p
bad-cre表达盒长度为2,269bp，neor/kanr基因长度为954bp电泳结果与理论大小一致。
70.2.iscg21基因敲除表达盒的构建
71.将上述扩增的四个dna片段：iscg21-u与arac-p
bad-cre表达盒，neor/kanr基因与iscg21-d，作为模板，先进行一轮overlap pcr，分别以iscg21-u-f/p8和p9/iscg21-d-r为引物扩增片段“uha-lox71-arac-p
bad-cre表达盒”和“kanr-lox66-dha”，再将上述扩增的两个dna片段再进行一轮overlap pcr，以iscg21-u-f/iscg21-d-r为引物扩增片段“uha-lox71-arac-p
bad-cre表达盒-kanr-lox66-dha”。
72.进行overlap pcr时，第一步pcr体系为：2
×
kod buffer 12.5ml，2.5mm dntps 5.0μl，两片段各50ng，kod dna polymerase 0.5μl，ddh2o补齐至25μl；其中pcr反应条件包括：94℃预变性5min，98℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸1kb/min，变性、退火和延伸过程循环5次，最后68℃延伸5min。随后进行的第二步pcr体系为：取第一步pcr产物，添加2
×
kod buffer 12.5ml，2.5mm dntps 5.0μl，引物1μl(引物浓度10mm)，kod dna polymerase 0.5μl，ddh2o补齐至50μl；pcr反应条件为：94℃预变性5min，98℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸1kb/min，变性、退火和延伸过程循环25次，最后68℃延伸5min。利用琼脂凝胶电泳验证扩增产物片段(图2)，uha-lox71-arac-p
bad-cre表达盒长度为3,069bp，kanr-lox66-dha长度为1,771bp，iscg21基因敲除表达盒长度为4,818bp，电泳结果与理论大小一致。
73.3.iscg21基因的敲除
74.将上述制备的iscg21基因敲除表达盒，1μg转入新鲜制备atcc13032-pxmj19-recet感受态细胞中，按照实施例1中电击转化的方法转化iscg21基因敲除表达盒。以p11/p12为引物，对在bhis(含卡那霉素20μg/ml及氯霉素10μg/ml)平板上长出的菌落进行pcr验证，iscg21基因敲除表达盒成功重组的菌株在4,958bp处有条带，野生菌株在3,123bp处有条带(图3)。
75.p11:caattccgcgcaggccttatccaa
76.p12:catccagccagactcccacccatga
77.挑取正确重组的转化子，诱导cre酶表达，执行lox71和lox66位点间序列的剪切，完成iscg21基因的敲除。诱导cre酶表达，执行lox71和lox66位点间序列的剪切及敲除菌株的筛选方法如下：将验证正确的转化子，挑取3株，接种于含7.5μg/ml氯霉素及2％浓度的阿拉伯糖的bhis液体培养基中，30℃，250rpm，摇菌24h；蘸取菌液，划线于含17μg/ml氯霉素的bhi固体培养基上，30℃，培养24h；将上述长出的单菌落分别点板于bhis(含卡那霉素20μg/ml及氯霉素10μg/ml)及bhis(含氯霉素17μg/ml)的平板上，30℃培养12h后，观察菌落的生长情况。在仅含氯霉素的平板上生长，同时在含氯霉素和卡那霉素的平板上不生长，初步鉴定有效剔除cre表达盒及kan筛选标记；用引物p11/p12进一步pcr验证，插入元件敲除突变
体在1,789bp左右处有条带，野生的对照菌株在3,123bp左右处有条带(图3)，进一步确定成功有效剔除cre表达盒及kan筛选标记；用引物p11/p12扩增的敲除菌株的条带进行测序，再一步确定基因组上的iscg21基因被34bp的lox72代替，测序结果表明获得iscg21元件敲除的菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21。
78.实施例3
79.插入序列元件iscg21删除突变株中叠加敲除iscg13a、iscg13b基因
80.按照实施例2中所述方法构建插入序列元件敲除组件，进一步构建敲除表达盒。其中arac-p
bad-cre表达盒和neor/kanr基因均不变，仅需要更换上下游同源臂引物为iscg13a-u-f/r和iscg13a-d-f/r、iscg13b-u-f/r和iscg13b-d-f/r，获得iscg13a、iscg13b基因敲除表达盒。
81.将实施例2中获得的菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21按照实施例1中所述方法制备成感受态，并完成iscg13a基因敲除表达盒的转化。以p13/p14为引物，对长出的转化子进行pcr鉴定，iscg13a基因敲除表达盒成功重组的菌株在4,926bp处有条带，野生菌株在3,773bp处有条带。按照实施例2中的方法，挑取正确的转化子完成cre酶的诱导切割，最终获得iscg21、iscg13a敲除的菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21-iscg13a。
82.p13:ggattcgatttccctggaagctctt
83.p14:tctgagaaagaaactgagcctgcag
84.将所获菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21-iscg13a按照实施例1中所述方法制备成感受态，并完成iscg13b基因敲除表达盒的转化。以p15/p16为引物，对长出的转化子进行pcr鉴定，iscg13b基因敲除表达盒成功重组的菌株在4,943bp处有条带，野生菌株在3,286bp处有条带。按照实施例2中的方法，挑取正确的转化子完成cre酶的诱导切割，最终成功获得了iscg21、iscg13a、iscg13b基因敲除的菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21-iscg13a-iscg13b。
85.p15:actccctgttccctcacacc
86.p16:caacaatgaaaattgcggtaatcggc
87.实施例4
88.插入序列元件家族删除突变株和共删除突变株的构建
89.将实施例3中所获得的菌株atcc13032-pxmj19-recet-δiscg21-iscg13a-iscg13b。通过在无抗生素的环境下，传代培养清除recet质粒，最终获得atcc13032-δiscg21-iscg13a-iscg13b(isdm027)此菌株为插入序列元件is1380家族删除突变菌株。
90.按照实施例3中所述方法，敲除目标插入序列元件后清除recet质粒，最后构建了isl3家族删除突变菌株atcc13032-δiscg1a-iscg1b-iscg1d(isdm023)，is30家族删除突变菌株atcc13032-δiscg2b-iscg2f-iscg2g(isdm024)，is6家族删除突变菌株atcc13032-δiscg3a-iscg3b-iscg15(isdm025)，is transposase家族删除突变菌株atcc13032-δiscg5a-iscg5b(isdm026)，is3家族删除突变菌株atcc 13032-δiscg6a-iscg6b-iscg8-iscg14-iscg16a-iscg16b(isdm028)和一种is元件共删除突变菌株atcc13032-δiscg1a-iscg1b-iscg1d-iscg2b-iscg3a-iscg3b-iscg8-iscg14-iscg21(isdm029)。构建的is元件删除突变菌株如表1所示，is元件敲除表达盒所用引物见表2。
91.实施例5
92.插入序列元件删除突变株生长测试
93.通过bioscreenc全自动生长曲线仪对野生型菌株atcc13032及本发明构建的7种谷氨酸棒状杆菌is元件删除突变菌株进行了24h内bhis培养基中的生长测试，每1h测量一次od
600
，温度为30℃。生长曲线测试结果如图4所示，结果表明，删除突变株在对数生长前期与野生型菌株基本一致，无明显生长差异；在对数生长后期，isdm025、isdm026、isdm028略高于野生型和其他删除突变株；而进入稳定期后，isdm025、isdm026、isdm028、isdm029均显示略高的生物量(终od
600
在1.120以上，isdm029菌株显示最高的终od
600
达到1.201
±
0.011)，而野生型及其他删除突变株终od
600
均维持在1.040左右。
94.该结果显示本发明构建的is元件删除突变株可能具有生长性状上的改变，故为进一步探究is元件删除带来的影响，使用了cgxⅱ培养基，分别从ph、葡萄糖浓度、na

浓度三个方向进行考察，其中部分结果如图5所示。在ph 7.0、na

浓度为0m时，isdm029在低碳源浓度(葡萄糖5g/l)条件下，显示了更高的比生长速率。这与之前在bhis中显现出相似性：在生长测试中后期，由于生长消耗使得培养基中的葡萄糖浓度降低，但是isdm029却显示出更高的生长速率；在cgxⅱ培养基中，在低碳源浓度下其生长优势明显。结果表明，本发明所构建的is元件删除突变菌株isdm029在低碳源情况下具有更高的生长速率。
95.实施例6
96.插入序列元件删除突变株电转效率
97.1.荧光质粒的构建
98.pec-xk99e质粒为e.coli-c.glutamicum穿梭载体，pzl041-jys1-tac-sfgfp质粒为荧光蛋白表达质粒，都为实验室保存。
99.以pec-xk99e为模板，p/p为引物，pcr扩增得到片段4(pec-xk99e质粒骨架部分)；以pec-xk99e为模板，p/p为引物，pcr扩增得到片段5(pec-xk99e质粒骨架部分)；以pzl041-jys1-tac-sfgfp为模板，分别以p/p为引物，分别以上轮pcr产物再做模板，共四轮pcr扩增得到片段6(h36-sfgfp/p57-sfgfp)。将片段4,5,6进行gibson组装，得到pec-xk99e-sfgfp质粒。
100.2.电转效率分析
101.参照实施例1中所述方法，将实施例4中构建的7株突变株制备感受态。参照实施例1中所述方法，电转化pec-xk99e-sfgfp质粒到野生型和7株突变株。活化3h后，取50μl菌液涂布于含有相应卡那霉素(25μg/ml)的bhis固体培养基上，30℃恒温培养48h至长出单菌落。对平板上长出的菌落进行计数。由图6可见，除isdm025的电转化效率(4,100
±
1,375cfu/μg)较野生型的电转化效率(3475
±
1050cfu/μg)提高17％外，其余插入序列元件删除突变菌株有1.3倍到11.5倍的提升，其中isdm029具有最高的电转化效率(43575
±
8775cfu/μg)。结果表明本发明所构建的is元件删除突变菌株具有更高的电转效率。
102.实施例7
103.插入序列元件删除突变株和重组效率分析
104.以p17/p18为引物，以实验室保存质粒psyn.f1为模板，得到人工基因组片段chunk a1.a1。随后电转化至含有recet质粒的野生型菌株和is元件删除突变菌株中，随后每种菌株挑取40个转化子进行以p19/p20为引物进行菌落pcr验证，结果如表3所示。
105.p17:agttcactctagcccctgcatagg
106.p18:cgaaccccagagtcccgc
107.p19:ctagttccctgaccaaaggcctg
108.p20:tcaacagggcggtttttccaatcaaaac
109.结果显示除isdm026外，其余删除突变菌株isdm023(30％)、isdm024(22.5％)、isdm025(17.5％)、isdm027(32％)、isdm028(30％)、isdm029(25％)均有不同程度的重组效率提升，其中is1380家族三个is元件删除的isdm027显示出最高的重组效率，为野生型(12.5％)的2.6倍。结果表明本发明构建的is元件删除突变株大部分能够提高重组效率。
110.实施例8
111.插入序列元件删除突变株外源蛋白表达分析
112.1.荧光表达测定
113.将实施例6中所得转化子，以p21/p22为引物，对长出的转化子进行pcr鉴定。成功转化pec-xk99e-sfgfp质粒的菌株在1,000bp处有条带，野生菌株没有条带。将所得转化子划线纯化后测序，确定sfgfp基因的完整。
114.p21:gtgagcgaggaagcggaagag
115.p22:ctactctcgcatggggagacc
116.分别将纯化后的转化子转入bhi培养基(添加卡那霉素25μg/ml)，30℃、220rpm恒温摇床中培活化培养12h后，转接至250ml锥形瓶中、新鲜bhi培养基(添加卡那霉素25μg/ml)培养至od
600
为1，取1ml菌液在6000rpm 4℃条件下离心5min收集菌体，用1
×
pbs洗涤一次，再用1
×
pbs调节od
600
至0.6～0.8获得重悬液。取200μl上述重悬液于带盖的96孔板中，1
×
pbs缓冲液为空白对照，以atcc13032-pec-xk99e空载为背景，采用tecan infinite m200 pro多功能光栅酶标仪，在激发波长为478nm和发射波长为515nm的条件下测定荧光强度，计算相对荧光强度，结果如图7所示
117.相对荧光强度＝[(实验组荧光强度-空白对照荧光强度)/(实验组od
600-空白对照od
600
)]-[(背景组荧光强度-空白对照荧光强度)/(背景组od
600-空白对照od
600
)]；
[0118]
结果显示，isdm029具有最高的gfp表达(相对荧光表达量达到6385
±
278)，较野生型菌株提高69.7％，其他删除突变株分别提高10.8％、8.1％、5.5％、6.5％、17.6％、8.6％。结果表明，本发明所构建的is元件删除突变菌株能够提高重组蛋白的生产表达。
[0119]
实施例9
[0120]
插入序列元件删除突变株表型异质性分析
[0121]
取上述测序正确且纯化后的转化子，挑取单菌落接种于10ml含有相应抗生素的bhis液体培养基，置于恒温摇床中30℃、220rpm培养12h，记为0代；每隔12h进行一次转接，即取上一步中100μl的菌液加入含有相应抗生素的新鲜bhis液体培养基中；进行17次转接后，停止转接，记为第100代(谷氨酸棒状杆菌在bhis中的倍增时间约为2h，每次转接约为6代)；取0代菌与第100代菌进行实施例7.1中荧光表达测定的操作，将重悬液的od
600
稀释至0.100以下，取1ml上述重悬液，置于5ml的流式管中。在bio-rad s3e cell sorter流式细胞仪中上样，相关参数为：fsc 399，ssc 386，fl1 600，采集细胞数为50,000个，获得流式分析结果，如图8a和图8b所示。
[0122]
流式分析结果显示，isdm029菌株在经历传代之后，高荧光细胞群体仍然保持(27.6％上升至32.8％)。而野生型菌株同其他删除突变株，高荧光细胞群体均有不同程度
上的降低，其中野生型由14.3％降至4.73％，其他删除突变株则有2％到9％不等的高荧光细胞群体的减少。结果证明，本发明所构建的is元件删除突变菌株isdm029能够增强菌株的稳定性，减少表型异质性的发生。
[0123]
实施例10
[0124]
插入序列元件删除突变株异源基因表达分析
[0125]
前述研究表明，isdm029可能是一株具有优良性状的生产宿主，通过引入外源的紫色杆菌素的合成基因簇到其中，考察其外源基因的生产表达能力。将本实验室保存的pec-viol1-zzh质粒(包含紫色杆菌素合成基因簇，p
tac
启动子诱导调控其表达)电转至isdm029中，同时电转至atcc13032作为对照。将得到的阳性转化子，在超净工作台中接种至装有10ml bhis(添加卡那霉素25μg/ml)培养基的离心管中，置于恒温摇床中30℃、220rpm培养12h，记为0代。取2ml菌液转接至装有50ml bhis培养基(添加卡那霉素25μg/ml)的250ml锥形瓶中，置于恒温摇床中30℃、220rpm培养12h。在超净工作台中，加入iptg诱导剂诱导紫色杆菌素的表达，转移至恒温摇床中20℃、220rpm培养48h，获得发酵液。同时取0代菌进行转接，具体操作参照实施例9中所述，在第10代、第20代、第30代取2ml菌液转接，重复前述操作获得发酵液。
[0126]
取5ml的发酵液置于50ml离心管中，然后以10,000
×
g离心5min，弃去上清。加入5ml灭菌处理的ddh2o，吹打细胞使其充分悬浮，10,000
×
g离心5min，弃去上清。加入5ml无水乙醇，通过超声波细胞粉碎机(200w和10min)破坏细胞，然后10,000
×
g离心5min，将乙醇提取物迅速转移至新的离心管中。重复上步骤至离心管底的细胞碎片颜色不再变化，将所有上清液作为紫色杆菌素的粗提取液收集，使用紫外线可见分光光度计在570nm处测量制备的紫色杆菌素的粗提乙醇溶液的吸光度。
[0127]
分别考察两株生产宿主在0代、10代、20代、40代的紫色杆菌素生产表达情况，计算紫色杆菌素的相对表达量，结果如图9所示。
[0128]
相对表达量＝(粗提粗液a
570
×
粗提取液体积)/(菌液od
600
×
制样菌液体积)
[0129]
第0代时，isdm029与野生型菌株均有较高的紫色杆菌素表达(分别为0.9870和0.8700)，可以观察到摇瓶的颜色都为紫黑色；第10代时，isdm029与野生型菌株仍有较高的表达(分别为0.8298和0.7305)，但低于先前的水平；第20代时，野生型菌株的紫色杆菌素表达量大幅下降(0.3614)，而isdm029仍维持与20代时相近的生产性能(0.8226)；而第40代时，野生型菌株在摇瓶中几乎没有紫黑色产生，与紫色杆菌素的粗提结果相映证，相对表达量仅为0.0719，不过isdm029在40代时，也显示了紫色杆菌素的表达量下降，相对表达为0.2606。结果表明，本发明所构建的is元件删除突变菌株isdm029进行紫色杆菌素的生产表达，较野生型而言，在20代内都具有更稳定的表达和更高的产量。
[0130]
本发明方法利用recet协助的cre/loxp系统敲除谷氨酸棒状杆菌atcc13032当中的插入序列元件，可以高效获得谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变株。本方法具有操作简单，方便易行等特点。本发明获得的工程菌株谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变株与出发菌株atcc13032相比：部分删除突变体的生物量升高；删除突变体的电转化效率提高，最高可达野生型的12.5倍；删除部分is元件后，重组效率得到提高；同时插入序列元件删除突变株显示出较野生型更高的荧光表达，gfp表达量最高提升69.7％；插入序列元件删除突变株isdm029显示了更少的表型异质性产生。插入序列元件删除菌株isdm029在紫色杆
菌素作为外源基因表达的情况下，在20代以内具有更稳定的外源基因表达和更高的生产能力。
[0131]
由此可见，与传统谷氨酸棒状杆菌相比，本发明获得的工程菌株谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变株，为实现外源蛋白稳定提供了良好的宿主菌株，具有良好的工业应用前景，同时也提供了一种利于代谢改造的出发菌株。
[0132]
表1本发明构建的is元件删除突变菌株
[0133][0134]
表2插入序列元件扩增上下游同源臂引物
[0135]
[0136]
[0137]
[0138][0139]
表3 is元件删除突变株的同源重组效率
[0140][0141]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述菌株缺失1个或多个插入序列元件。2.根据权利要求1所述谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述序列元件选自isl3、is30、is6、is3、is1380以及is transposase家族的基因中的一种以上。3.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分isl3家族基因。4.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is30家族基因。5.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is6家族基因。6.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is3家族基因。7.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is1380家族基。8.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分is transposase家族基因.9.根据权利要求谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌菌株敲除全部或部分敲除插入序列元件。10.权利要求1～9任一项所述构建的菌株应用，其特征在于，作为外源蛋白表达和代谢物合成的宿主菌株。

技术总结
本发明公开一种谷氨酸棒状杆菌的插入序列元件删除突变菌株的构建其应用，涉及微生物工程领域。所述的谷氨酸棒状杆菌插入序列元件删除突变菌株是谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032敲除部分或全部插入序列元件后的菌株。所获得的插入序列删除突变株，DNA电转化效率和外源蛋白表达稳定性显著高于野生型菌株ATCC13032的能力。本发明所构建谷氨酸棒状杆菌插入序列删除突变菌株，可以用于谷氨酸棒状杆菌表达系统的宿主菌，用于重组制备外源蛋白(酶)，也为谷氨酸棒状杆菌工程菌的改造提供了一种新的方法。方法。方法。


技术研发人员：叶燕锐 张国超 林章凛
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25