一种香菇多糖抗菌复合物及其制备方法

1.本发明涉及纳米材料制备技术领域，具体而言，涉及一种香菇多糖抗菌复合物及其制备方法。


背景技术：

2.目前，研究发现很多纳米材料具有优异的抗菌效果，如一些金属纳米材料、金属氧化物纳米材料、石墨烯类纳米材料等。这些新型的纳米抗菌材料也逐步应用于抗菌农药领域，但目前大量研究集中于纳米银等产量较高、应用较广泛的纳米金属。但是，纳米银等重金属粒子会产生一定的生物蓄积毒性，也会对水环境产生较复杂的毒理效应。


技术实现要素：

3.本发明正是基于上述技术问题至少之一，本发明提供一种香菇多糖抗菌复合物及其制备方法，其中香菇多糖抗菌复合物具体为香菇多糖/纳米氧化锌复合物，其对植物病原菌具有良好的抑制活性，因而本发明香菇多糖/纳米氧化锌复合物可以用于抗菌机能农药或其他抗菌产品中。
4.有鉴于此，根据本发明的第一个方面提供一种香菇多糖抗菌复合物的制备方法，包括以下步骤：
5.将香菇多糖与浓度为0.4-1mol/l氢氧化钠混合后搅拌15-30分钟并滴加醋酸锌溶液；其中所述香菇多糖与所述氢氧化钠溶液的添加量为30-50mg/ml；
6.将上述混合溶液搅拌至透明后密封80-120℃，反应2-12小时；
7.将反应后的溶液透析处理后冷冻干燥即可。
8.本实施例中氢氧化钠的浓度越高所需搅拌时间越短，保证香菇多糖三螺旋构象的破坏即可，搅拌时间过长会导致香菇多糖分子的降解。在一些实施例中，所述醋酸锌与香菇多糖质量比为0.5-10:1。
9.在一些实施例中，将上述混合溶液搅拌至透明后调节ph值为8-12。
10.本实施例中滴加所述醋酸锌溶液后调节最终的ph值需为8-12，保证反应期间溶液整体偏弱碱性且香菇多糖可复性为三螺旋构象，调节方式主要通过氢氧化钠溶液和醋酸锌溶液的浓度来控制。香菇多糖螺旋构象重组过程中包覆氧化锌纳米颗粒，阻止其粒径不断增加，根据ph的不同可调节香菇多糖复性的速度，获得不同粒径的香菇葡聚糖基纳米氧化锌。
11.在一些实施例中，所述透析方法为：将加热反应后所得的溶液分散在水中用去离子水后进行5-8kd的纤维素半透膜透析。
12.本实施例中加热反应后所得的混合液分散在水中，利用去离子水透析后冷冻干燥，最终得到香菇多糖/纳米氧化锌复合物。
13.根据本发明的第二个方面提出一种菇香菇多糖抗菌复合物，其利用上述任一实施例中的方法制备得到，其中菇香菇多糖抗菌复合物具体为香菇多糖/纳米氧化锌复合物。
14.根据本发明的第三个方面提出上述实施例中所述的菇香菇多糖抗菌复合物在抗菌农药中的应用。
15.本实施例中其中香菇多糖/纳米氧化锌复合物对植物病原菌具有良好的抑制活性，因而本发明实施例中的香菇多糖/纳米氧化锌复合物可以用于抗菌机能农药或其他抗菌产品中。
16.本发明具有如下优点：
17.(1)整个制备反应过程中无有毒物质或环境污染物，绿色环保且香菇多糖/纳米氧化锌复合物粒径大小可控的具有良好的应用前景。
18.(2)利用香菇多糖/纳米氧化锌复合物合成反应体系中ph值的变化实现香菇多糖三螺旋
→
单链
→
复性三螺旋的构象转变，进而实现纳米复合物的包覆和分散。
19.(3)操作步骤简单易行，制备的香菇香菇多糖基/纳米氧化锌粉末具有很好的水溶液再分散性能和对植物病原菌的抑制活性。
附图说明
20.图1为本发明实施例1提供的香菇多糖基/纳米氧化锌粉末的扫描电镜图谱。
21.图2是本发明实施例提供的不同样品的激光粒径分布图。
22.图3是本发明实施例提供的不同样品的x射线衍射图。
23.其中a、b、c、d依次为实施例1、2、3中提供的香菇多糖/纳米氧化锌复合物和香菇多糖。
具体实施方式
24.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
26.需要说明的是实施例中若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售分析纯试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
27.实施例1
28.将500mg香菇多糖溶解于10ml浓度为0.41mol/l的氢氧化钠水溶液中，持续搅拌30分钟，充分破坏香菇多糖的三螺旋构象；室温下，取440mg二水醋酸锌溶于10ml水中；将上述两溶液混合，搅拌至透明后，加适量水，调节ph值为11，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。反应结束后得到均一的胶体溶液，底部无沉淀。继续透析处理，最终干燥制备成香菇多糖基/纳米氧化锌粉末，具有良好的再分散效果。取少量粉末进行扫描电镜观察，如图1所示，可以看出在香菇多糖基底上有大量偏球形的纳米颗粒，其粒径均小于100nm，分散的较为均匀，无明显聚集现象，说明香菇多糖的包覆作用具有良好的分散效果。
29.实施例2
30.将500mg香菇多糖溶解于15ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠水溶液中，持续搅拌30
分钟，充分破坏香菇多糖的三螺旋构象；室温下，取1320mg二水醋酸锌溶于10ml水中；将上述两溶液混合，搅拌至透明后，加适量水，调节ph值为11，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。反应结束后得到均一的胶体溶液，底部无沉淀。反应结束透析处理，最终干燥制备成香菇多糖基/纳米氧化锌粉末，具有良好的再分散效果。
31.实施例3
32.将500mg香菇多糖溶解于10ml浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液中，持续搅拌15分钟，充分破坏香菇多糖的三螺旋构象；室温下，取2.2g二水醋酸锌溶于20ml水中；将上述两溶液混合，持续搅拌下滴加适量氢氧化钠溶液，调节ph值为11，搅拌至透明后，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。反应结束后得到均一的胶体溶液，底部无沉淀。反应结束透析处理，最终干燥制备成香菇多糖基/纳米氧化锌粉末，具有良好的再分散效果。
33.对比例1
34.取2.2g二水醋酸锌溶于20ml水中，持续搅拌下滴加适量氢氧化钠溶液(1mol/l)，直至ph值为11，搅拌至透明后，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。合成过程中不加香菇多糖进行分散，反应结束后底部有大量灰白色纳米氧化锌沉淀，与文献报道类似，用水冲洗后，取少量超声分散后用激光粒径仪观测其粒径分布，其余干燥制备成纳米氧化锌粉末，再分散效果较差，数分钟后聚沉。
35.对比例2
36.将500mg香菇多糖溶解于10ml浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液中，持续搅拌15分钟，充分破坏香菇多糖的三螺旋构象；室温下，取440mg二水醋酸锌溶于40ml水中；将上述两溶液混合，搅拌至透明后测其ph为13，由于ph值过高，所加香菇多糖不能复性，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。反应结束后可以看出底部有大量沉淀。说明香菇多糖不能复性，不能完成对那么氧化锌的包覆作用，纳米氧化锌不断聚集发生沉淀，取少量超声预分散后观测其粒径分布，如图所示，可以看出其粒径，远大于香菇多糖包覆分散合成的纳米氧化锌。其余部分最终干燥制备成香菇多糖基/纳米氧化锌粉末，再分散效果较差，数分钟后聚沉。
37.对比例3
38.将500mg香菇多糖溶解于10ml浓度为0.41mol/l的氢氧化钠水溶液中，持续搅拌30分钟，充分破坏香菇多糖的三螺旋构象；室温下，取440mg二水醋酸锌溶于10ml水中；将上述两溶液混合，搅拌至透明后，加适量水，调节ph值至11，密封加热反应，加热温度为130℃，反应时间为12小时。反应温度过高，氧化锌纳米粒子生成速度较快，反应前期在高温反应管中即可观察到沉淀生成。在高温下，糖链运动活跃，香菇多糖很难完成复性及对纳米氧化锌的包覆作用。反应结束后可以看出底部有大量沉淀，清洗后制备得到纳米氧化锌粉末，再分散效果较差，数分钟后聚沉。
39.对比例4
40.先配置10ml浓度为0.41mol/l的氢氧化钠水溶液，取440mg二水醋酸锌溶于10ml水中；将上述两溶液混合，搅拌至透明后，加适量水，调节ph值为11，再将500mg香菇多糖溶解于其中(此ph下，香菇多糖保持三螺旋构象)，密封加热反应，加热温度为100℃，反应时间为12小时。香菇多糖未进行变性-复性重组的过程，不能完成对纳米氧化锌的包覆。反应结束
后可以看出底部有大量沉淀，清洗后制备得到纳米氧化锌粉末，再分散效果较差，数分钟后聚沉。说明香菇多糖必须完成先变性再复性重组的过程才能对氧化锌有良好的包覆效果。
41.实施例4
42.采用激光粒度仪(microtracs 3500型)及x射线衍射仪(xrd，d8advance型)观察不同样品的粒径及xrd图谱。分别取香菇多糖，实施例1-3中的香菇多糖基/纳米氧化锌粉末以及对比例1-2得到的参照样品纳米氧化锌各10mg超声预分散3ml水溶液中，迅速测量其粒径分布，结果如图2所示。可以看出实施例1-3所合成的香菇多糖基/纳米氧化锌粉末再分散后依然具有良好的纳米级分布，其粒径随着香菇多糖比例的下降有所上升，复合物在水溶液中平均粒径均小于400nm。香菇多糖基/纳米氧化锌粉末以及香菇多糖大分子本身在溶液中的粒径分布均为其水和半径，可以明显看出要高于扫描电镜观察结果。检测后溶液放置较长时间可保持均一无沉淀。对比例1和对比例2再分散效果较差，均为微米级粒径，测量后放置数分钟，底部可见沉淀，再分散效果较差。对比例1中香菇多糖未能及时复性成三螺旋构象完成包覆纳米氧化锌，但其对纳米氧化锌的吸附效果也可一定程度降低其平均粒径。对实施例1、2、3及香菇多糖进行x射线衍射，其中a、b、c、依次为实施例1、2、3中的香菇多糖/纳米氧化锌复合物，d为香菇多糖，其a、b、c、d的xrd表征结果如图3所示。香菇多糖为天然高分子非晶态结构，无明显特征吸收峰。实施例1-3合成所得的香菇多糖基/纳米氧化锌粉末出现多处衍射峰，与氧化锌标准卡片对比结果显示均为六方纤锌矿相，说明成功合成了氧化锌晶体，不含氢氧化锌等其他杂质。
43.实施例5
44.应用本发明实施例1-3合成的香菇多糖基/纳米氧化锌粉末以及对比例1-2得到的参照样品纳米氧化锌测试对不同植物病原菌的抑制效果。
45.抗菌实验所用植物病原细菌，主要有烟草青枯病菌、白菜软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌和青枯雷尔氏菌等。病原真菌主要有烟草棒孢叶斑病菌、甜瓜蔓枯病菌、仓储烟叶霉菌黑曲霉和桔青霉等。采用微量稀释法，测试氧化锌对几种植物病原细菌的mic。病原菌振荡培养至对数期，并稀释至106cfu/ml。每种病原菌采用单独的96孔板进行测试。采用二倍稀释法逐级低级，给药量以氧化锌含量计，范围为(512μg/ml-4μg/ml)，每孔培养体积为200μl。每样重复3次。用无菌培养基作空白对照。将96孔板放入生物培养箱中，37℃培养24h，酶标仪600nm波长下测量吸光度，并结合肉眼观察，如果某浓度下样品浊度未变化而比其低一浓度级别样品浊度发生变化，则该浓度为该样品的mic值，结果如表1所示。
46.表1香菇多糖及不同纳米氧化锌对植物病原细菌的mic值
47.48.如表1所示，香菇多糖无抑菌活性，说明给药量以氧化锌含量计算是合理的，香菇多糖在对植物生物防治的过程中，一般是作为诱抗剂，不直接产生抑菌灭毒的活性。实施例所得香菇多糖基/纳米氧化锌粉末抑菌活性明显好于参照样品纳米氧化锌的抗菌活性，有开发成为抗细菌农药的潜力。纳米氧化锌粒径越小，相对来说抑菌活性越好。另外氧化锌对不同的病原菌的抑制效果差异也较大，从表1中可以看出，纳米氧化锌对青枯雷尔氏菌抑制效果明显好于其他病原菌。
49.真菌的抑菌作用通过对不同真菌的菌丝径向生长来评价其抗菌活性。将不同真菌分别制备成孢子悬液，将以不同浓度的纳米氧化锌复合物(浓度以氧化锌含量计)联合pda培养基混合培养，无菌水作为对照。将新鲜的孢子悬浮液(106cfu/ml)种于pda培养基的平板中心。接种好的平板在28℃下孵育3天。用码游标卡尺测量真菌径向生长的平均直径，与空白样品对比计算其生长抑制率(e，％)，结果如表2所示。
50.e＝[(a-b)/a]
×
100％，其中a为空白对照组径向生长直径，b为样品处理组真菌径向生长直径。
[0051]
表2不同纳米氧化锌对植物病原真菌的抑制率
[0052][0053]
结果如表2所示，可以明显看出实施例所得两种香菇多糖基/纳米氧化锌粉末对病原菌的抑制效果都优于对比例所得纳米氧化锌，实施例1抑菌活性略好于实施例3。
[0054]
综上所述，本发明利用金种子来生长纳米合金的方法，获得了粒径更为均一、杀菌效果相比纯银纳米粒子更好、而细胞毒性更低的香菇多糖基金-银纳米粒子。
[0055]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
[0056]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人
员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。