CCM3、p-Paxillin及p-FAK作为脑海绵状血管瘤的生物标记物的用途

ccm3、p-paxillin及p-fak作为脑海绵状血管瘤的生物标记物的用途
技术领域
1.本发明涉及疾病诊断技术领域，尤其涉及一种ccm3、p-paxillin及p-fak作为脑海绵状血管瘤的生物标记物的用途。


背景技术：

2.血管网络的形成对于维持机体的正常生命活动是必不可少的，各类营养物质能通过血管网络运输到机体的各个部位，从而为各组织器官提供能量和物质。血管的生成通常可以分为血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。前者是指中胚层来源的血管前体细胞或干细胞分化成血管网络的过程，该过程主要发生在胚胎发育早期，而血管生成是在原有血管基础上，内皮细胞增殖和迁移形成新血管的过程，该过程广泛发生在生理(如胚胎发育、产后组织修复)和病理(肿瘤、感染和免疫紊乱)过程。
3.内皮细胞的运动迁移能力对于血管生成过程十分重要，特别是顶端细胞(tip cell)的迁移决定了新生血管延伸的方向和距离，因此维持内皮细胞正常的迁移能力对于正常血管的结构和功能具有重要意义。
4.通常细胞的迁移是细胞受到外界信号(肽或蛋白、代谢产物或细胞残片等)刺激后，激活细胞膜上受体，进而激活下游通路。这些激活的通路会引起细胞内与迁移相关的物质的重分布，细胞显现出“前”“后”两端，如β肌动蛋白的mrna，arp2/3复合体和一些化学感受器会出现前多后少的分布状况，而ca
2
的分布相反，这种重分布能促进细胞的移动性。细胞内微丝的生长和已有粘着斑(focal adhesion)的解离促进了细胞“伪足”的前伸，“伪足”伸长到一定位置后，前端的粘着斑又进行重装配从而固定“伪足”，接着细胞后端能通过激活rho激酶(rock)通路磷酸化肌球蛋白轻链(mlc)促进收缩、以及后端粘着斑的解离使得细胞后端朝前端移动。
5.目前在实验水平调节细胞运动的方法主要是添加外源物针对参与细胞运动的各组分，如致癌物佛波酯(phorbol ester)能不可逆激活ras从而促进细胞迁移，维多珠(vedolizumab，vdz)能选择性结合α4β7integrin从而抑制细胞迁移。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ccm3、p-paxillin及p-fak作为脑海绵状血管瘤的生物标记物的用途。
7.本发明发现了一种新的细胞内源性蛋白ccm3能与粘着斑组分桩蛋白(paxillin)相互作用，维持正常的粘着斑功能，ccm3蛋白的缺失导致paxillin和粘着斑激酶(fak)的异常磷酸化从而影响粘着斑的解离与装配，最终影响内皮细胞的迁移功能。
8.本发明发现在内皮细胞中敲除ccm3(crispr-ccm3)后，除了线粒体发生显著变化外，细胞连接也发生显著变化，表现为crispr-ccm3内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，epcs)更不容易被胰蛋白酶trypsin消化。粘着斑连接在细胞与细胞外基质相互连接
过程中起重要作用，因此我们首先检测了粘着斑连接相关基因在crispr-con和crispr-ccm3 epc中的表达情况，qrt-pcr表明粘着斑连接的主要蛋白如itgb1、paxillin和fak的表达量并未明显变化，而crispr-ccm3 epc中paxillin和fak的磷酸化水平显著增强，并且crispr-ccm3epc的迁移能力显著降低。
9.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测ccm3、p-paxillin和/或p-fak的试剂在制备检测脑海绵状血管瘤的试剂中的用途，所述ccm3、p-paxillin及p-fak是脑海绵状血管瘤的标记物。
10.本发明同时提供一种ccm3基因在抑制细胞迁移功能中的用途。
11.细胞迁移首先需要细胞头部伸出伪足并通过粘着斑连接与细胞外基质连接，然后解除细胞尾部的粘着斑连接，通过细胞骨架的收缩导致细胞往头部移动，我们推测crispr-ccm3导致的paxillin过度磷酸化可能使得粘着斑连接无法正常组装与去装配，从而抑制了细胞迁移，通过贴壁时间梯度实验及western blotting检测，我们发现ccm3-ko在细胞贴壁初期(1h)已导致paxillin磷酸化增加，而fak磷酸化并未显著变化，随着贴壁时间延长(4h及以上)，crispr-ccm3 epc中paxillin的磷酸化始终保持高水平，且fak的磷酸化水平显著高于crispr-con epc，可能的机制是贴壁初期，fak的磷酸化处于较高水平，当细胞贴壁完成后，细胞不在需要fak处于高磷酸化状态，因为p-fak不仅参与粘着斑连接的装配，还参与细胞迁移、侵入以及angiogenesis等过程，所以crispr-con epc中p-fak的水平会下降，而crispr-ccm3 epc中由于p-paxillin持续激活而导致p-fak处于激活状态。免疫荧光染色结果表明crispr-ccm3 epc中p-paxillin聚集在细胞外边缘，一方面导致细胞边缘粘着斑连接增强，另一方面可能使得细胞无法在头部伸出伪足，从而严重抑制细胞迁移功能。接下来我们研究ccm3与paxillin间的相互作用机制。
12.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抑制细胞迁移功能包括增加细胞粘着斑连接和增强细胞贴壁能力。
13.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述细胞为内皮细胞。
14.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抑制细胞迁移功能是通过降低ccm3基因的表达影响内皮细胞中p-paxillin的表达和分布从而抑制细胞迁移功能。
15.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抑制细胞迁移功能具体为：ccm3蛋白通过与paxillin直接结合从而维持paxillin正常磷酸化水平，当ccm3缺失时，p-paxillin持续保持激活状态，导致细胞与细胞外基质的粘着斑连接增强，抑制细胞迁移功能。
16.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述降低ccm3基因的表达包括敲除ccm3基因。
17.本发明同时提供ccm3基因在制备抑制细胞迁移功能的药物中的用途。
18.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抑制细胞迁移功能包括增加细胞粘着斑连接和增强细胞贴壁能力。
19.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抑制细胞迁移功能是通过降低ccm3基因的表达影响内皮细胞中p-paxillin的表达和分布从而抑制细胞正常迁移功能。
20.本发明的有益效果：
21.本发明首次发现，ccm3蛋白能通过与paxillin直接结合从而维持paxillin正常磷酸化水平，当ccm3缺失时，p-paxillin持续保持激活状态，导致细胞与细胞外基质的粘着斑
连接增强。有助于深入研究ccm3与paxillin间的相互作用机制。
附图说明
22.图1：crispr-ccm3处理增加磷酸化粘着斑连接从而增强细胞与细胞外基质连接；其中a：trypsin消化crispr-con和crispr-ccm3 epc时间梯度测试；b：qrt-pcr检测crispr-con和crispr-ccm3 epc中细胞连接相关基因表达；c：western blotting检测crispr-con和crispr-ccm3 epc中细胞连接蛋白的表达。统计结果表示为平均值
±
sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
23.图2：crispr-ccm3影响内皮细胞中p-paxillin的分布导致细胞无法正常迁移；其中a：相同数量的crispr-con和crispr-ccm3细胞培养不同时间点后贴壁细胞数量的变化；b：crispr-con和crispr-ccm3细胞分别培养1h，4h和8h后，粘着斑连接相关蛋白水平变化；c：经不同时间培养后，p-paxillin在crispr-con和crispr-ccm3细胞中分布。统计结果表示为平均值
±
sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，比例尺：50μm(c)。
24.图3：ccm3通过与paxillin直接相互作用影响其磷酸化；其中a：在crispr-ccm3细胞中过表达ccm3野生型和4ke突变型后粘着斑连接蛋白变化；b：在crispr-ccm3细胞中过表达ccm3野生型和4ke突变型后p-paxillin的水平以及分布；c：p-paxillin在上述不同处理中的平均荧光强度(mfi)统计；d：在crispr-ccm3细胞中过表达ccm3野生型和4ke突变型后细胞迁移能力的变化及统计(e)；统计结果表示为平均值
±
sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，比例尺：10μm(b)。
25.图4：rna-seq和atac-seq测序检测ccm3-ko对内皮细胞基因表达的影响；a：crispr-con和crispr-ccm3 epc中显著性差异基因统计；b：gene ontology biological process(gobp)分析差异性基因所在的信号通路；c：atac-seq测序得到染色质开放区域(openchromatinregion)显著变化的基因种类；d：atac-seq测序结果中染色质开放区域显著变化的基因在rna-seq测序结果中的变化。
26.图5：normal和ccm病人血管组织的粘着斑连接相关蛋白的磷酸化水平变化。
具体实施方式
27.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
28.1实验材料
[0029][0030]
2实验方法
[0031]
2.1本发明用到的qrt-pcr引物
[0032][0033][0034]
2.2胰蛋白酶trypsin时间梯度消化细胞
[0035]
(1)在10cm培养皿中培养内皮细胞(epc)和周细胞(pericytes)，待细胞长满备用；
[0036]
(2)将不同处理的细胞消化重悬，并检测细胞浓度，分别在12孔板中种同样浓度的细胞，根据预设时间梯度的数目，各时间点安排3个孔重复，将12孔板置于培养箱中培养过夜；
[0037]
(3)首先取出一块12孔板(以1min消化时间点为例)，吸弃所有上清，用dpbs清洗2遍以去除残余的培养基，依次在各孔加入200μl 0.05％trypsin，消化1min后依次加入200μl fbs终止消化，并尽量保证加trypsin所用的时间与加fbs所用的时间一致，吸弃上清，并用dpbs清洗3遍，尽量洗去已被消化下来的细胞，剩余的细胞全部消化后检测浓度；
[0038]
(4)依次取出12孔板，按照步骤(3)检测不同时间点剩余细胞浓度；
[0039]
(5)各孔以0分钟时间点(即全部细胞)为100％，计算其余时间点剩余细胞百分比，并进行统计分析。
[0040]
2.3细胞贴壁时间梯度测试
[0041]
(1)在10cm培养皿中培养已处理的细胞，待细胞长满备用；
[0042]
(2)将不同的细胞消化重悬，并检测浓度，在12孔板中每个孔均加入等量细胞(可加10
4-105细胞)，各时间梯度细胞种在一块12孔板中，置于co2培养箱37℃培养；
[0043]
(3)培养到设定的时间点(如0.5h或1h)时，拿出12孔板，吸弃上清，用dpbs清洗3遍，尽量洗掉未贴壁的细胞，剩余的细胞全部消化重悬，检测浓度；
[0044]
(4)以起始加入细胞为100％，计算各时间点贴壁细胞的百分比，并进行统计分析。
[0045]
2.4过表达ccm3-wt和ccm3-4ke质粒构建及慢病毒包装
[0046]
ccm3-wt和ccm3-4ke过表达质粒均来自于本实验室制备保留(li x,zhang r,zhang h,et al.crystal structure of ccm3,a cerebral cavernous malformation protein critical for vascular integrity[j].journal of biological chemistry,2010,285(31):24099-24107.)，慢病毒包装流程如下：
[0047]
(1)准备细胞，使用常规含10％fbs和1％双抗的dmem培养基将293t细胞培养至融合度80％左右(通常培养于10cm培养皿)；
[0048]
(2)将293t培养基换成opti-mem(通常加入7.2ml)，然后准备转染体系。
[0049]
过表达体系：
[0050][0051]
crispr敲除体系：
[0052]
[0053][0054]
各体系a液和b液等体积混合，置于室温20min；
[0055]
(3)将混合后的转染体系小心滴加至293t细胞中，并轻轻晃匀，注意不要使293t细胞飘起来，置于co2恒温培养箱中培养6-8h；
[0056]
(4)吸弃上清，小心加入无双抗的dmem 10％fbs，继续培养；
[0057]
(5)48h后收取上清至离心管中，4℃，3000g离心15min去除细胞碎片，离心后上清液用0.45μm孔径滤膜过滤后分装冻存。
[0058]
2.5crispr-ccm3 epc中过表达ccm3-wt和ccm3-4ke
[0059]
在crispr-ccm3处理后的epc中使用plex载体过表达ccm3-wt和ccm3-4ke时，按常规培养基egm2：病毒液＝1：1，并按1：1000加入8mg/ml聚凝胺polybrene(总体积为正常培养体积一半)，感染4h后补加培养基至正常培养体积，12h后换液，按实验需求在过表达48h或5天后收样检测，流程概述如下：
[0060]
(1)确定合适的抗生素筛选浓度：6孔板中铺合适量未经任何处理细胞，加入不同终浓度嘌呤霉素(0，0.5，1，2μg/ml)，每天更换含嘌呤霉素的培养基，直到3-4天左右使细胞全部死亡的最小浓度为合适的筛选浓度；
[0061]
(2)适量细胞种于6孔板中，培养至第二天汇合度约为50％左右，换成常规培养基(内皮细胞为egm2)和病毒液各500μl，并加入1μl 8mg/ml polybrene，培养4h后，再补加1ml egm2培养基至正常培养体积(6孔板用2ml培养基)，12h以后再更换为正常培养基，继续培养至48h；
[0062]
(3)将细胞传代至6cm培养皿(同时在另一6cm培养皿中培养未经任何处理的细胞作为对照)，一方面避免6孔板中细胞太密导致细胞死亡，另一方面保证开始筛选时细胞密度合适(50-60％)，传代第二天开始加入合适浓度的嘌呤霉素筛选，当对照组全部死亡后(预计3d左右)，实验组细胞继续传代至10cm培养皿，可用于后续实验以及扩大培养后冻存保种。
[0063]
2.6 rna-seq测序
[0064]
rna-seq测序由耶鲁大学医学院测序中心完成，流程概述如下：
[0065]
(1)提取总rna，对rna样品进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；
[0066]
(2)用oligodt引物逆转录mrna，将cdna片段化，并连接上测序接头引物，pcr扩增构建cdna文库；
[0067]
(3)检测文库质量，质量合格的文库进行上级测序，得到测序数据；
[0068]
(4)对测序数据进行数据过滤，除掉核糖体rna和测序质量低的数据，统计各基因reads数量，进行差异基因分析和差异基因富集分析等。
[0069]
2.7 atac-seq测序(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing)
[0070]
atac-seq测序由耶鲁大学干细胞中心测序实验室完成，建库流程具体可参见文献(buenrostro j d,giresi p g,zaba l c,chang h y,greenleaf w j.transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin,dna-binding proteins and nucleosome position.nature methods.2013；10(12):1213-1218.)，流程概述如下：
[0071]
(1)准备细胞核，不同处理的细胞各收5*104个细胞，pbs清洗后500g离心5min，吸弃上清，加入预冷的裂解液(10mm tris-hcl，ph 7.4，10mm nacl，3mm mgcl
2 and 0.1％igepal ca-630)，裂解完成后立即于4℃500g离心10min，小心吸弃上清，保留沉淀；
[0072]
(2)转座酶处理及纯化，上一步沉淀加入转座酶反应体系(25μl 2
×
td buffer，2.5μl transposase(illumina)and 22.5μl nuclease-free water)，37℃反应30min，反应产物用qiagen minelute kit试剂盒纯化；
[0073]
(3)pcr扩增，使用1
×
nebnext pcr mastermix和1.25μm nextera pcr primers 1和2(其中1是通用的，2是根据转座酶上的引物不同而不同)，pcr程序如下：
[0074][0075][0076]
pcr产物用qiagen pcr cleanup kit纯化，送qc和测序。
[0077]
2.8 he染色
[0078]
(1)4％pfa固定，oct包埋，5μm厚切片；
[0079]
(2)pbs冲洗2次，去除oct，pbs中0.3％tritonx-100中5％驴血清半小时，阻断非特异性染色，渗透切片组织；
[0080]
(3)将载玻片与抗cd31(1:100)、抗p-paxillin(1:100)、抗p-fak(1:100)等一抗在4℃下孵育过夜，pbs洗3次，与二抗(1:200～1:400)在室温下孵育1小时；
[0081]
(4)在pbs中洗涤三次后，用dapi(vector laboratory)将载玻片用vectashield安装介质进行安装，并拍照。
[0082]
3实验结果
[0083]
3.1 crispr-ccm3内皮细胞与细胞外基质连接增强
[0084]
在构建crispr-ccm3稳定敲除ccm3的epc细胞过程中，意外发现crispr-ccm3 epc细胞在传代时比正常细胞更不易trypsin消化，说明其贴壁能力或者说细胞与细胞外基质连接的能力增强，因此我们使用trypsin做细胞消化的时间梯度测试，在六孔板中加入200μl 0.05％trypsin，分别消化0，1，2，3，4，5，6min，加入fbs终止消化，吸弃已消化下来的细
paxillin分布均匀，且呈一定的方向性(图2c)，说明crispr-ccm3导致p-paxillin增加，并聚集在细胞外侧边缘，可能一方面导致细胞边缘粘着斑连接异常增强，另一方面也使得细胞失去极性，无法确定头部和尾部伪足的位置，从而导致细胞无法正常迁移。
[0090]
3.3ccm3通过特定位点赖氨酸(lysines)与paxillin相结合并影响paxillin的磷酸化
[0091]
上述实验已证明crispr-ccm3影响p-paxillin正常的表达水平和分布，接下来我们进一步研究ccm3蛋白如何调控paxillin的活性。鉴于已有文献证实ccm3可通过fat-h结构域与paxillin蛋白连接，因此我们推测ccm3与paxillin的直接相互作用会影响paxillin的磷酸化。并且文献还证明ccm3蛋白序列中第132，139，172，179共4个赖氨酸突变成谷氨酸(4ke mutation)后，ccm3将不能与paxillin结合，因此我们在lentiorfplex-mcs质粒骨架上构建了ccm3-4ke突变蛋白过表达质粒，以期证明ccm3与paxillin直接相互作用会影响paxillin的功能。
[0092]
我们在crispr-ccm3细胞中再过表达ccm3(野生型)和ccm3-4ke突变蛋白后检测粘着斑连接蛋白表达变化，western blotting结果表明过表达ccm3野生型而不是4ke突变型能显著降低p-paxillin的水平(图3a)，尽管p-fak的水平在过表达ccm3野生型和突变型中变化并不明显，可能的原因是p-fak不仅调控粘着斑连接的形成，而且还参与许多下游的信号通路，因此还存在其他调节因素调节fak磷酸化水平。此外，免疫荧光染色结果表明p-paxillin在crispr-ccm3细胞中表达量显著上升，以及在细胞边缘显著聚集；在crispr-ccm3细胞中重新过表达ccm3野生型能使p-paxillin恢复到正常的水平，而过表达ccm3-4k突变蛋白则不能恢复p-paxillin的水平(图3b和图3c)。细胞划痕实验也证明在crispr-ccm3细胞中过表达ccm3野生型能恢复细胞正常的迁移能力，而过表达ccm3-4ke突变体则不能(图3d和图3e)。
[0093]
综上所述，ccm3蛋白能通过与paxillin直接结合从而维持paxillin正常磷酸化水平，当ccm3缺失时，p-paxillin持续保持激活状态，导致细胞与细胞外基质的粘着斑连接增强。
[0094]
3.4 rnaseq分析crispr-con和crispr-ccm3细胞基因表达差异
[0095]
鉴于我们在实验过程中发现了在内皮细胞中敲除ccm3后会造成多种不同的现象，我们希望能找出其中的联系，因此我们采用rna-seq分析了crispr-con和crispr-ccm3细胞的基因表达情况，结果表明crispr-ccm3细胞相比crispr-con细胞显著上调基因有491个，显著下调的有444个(图4a)，通路富集说明crispr-ccm3细胞中adherensjunction和粘着斑连接通路显著增强，而cellmigration和proliferation等通路显著下降(图4b)，rna-seq结果与实验所得结果一致。
[0096]
同时，我们对crispr-con和crispr-ccm3细胞进行了atac-seq测序，检测基因组中染色质开放区域(openchromatinregion，ocr)在ccm3-ko处理中的变化，结果表明在crispr-ccm3处理后，klf家族包括klf4多个基因的开放区域显著增加(图4c)，即这些基因的翻译可能性大大增加，但这并不代表该基因的翻译一定增强，rna-seq结果表明klf4 mrna在ccm3-ko后显著增加，而klf5、1、3和14没检测到表达或者变化并不显著(图4d)，而gata家族基因开放区域在ccm3-ko后显著减少(图4c)，rna-seq结果则表明只有gata3的表达下降，gata3作为重要的转录因子可能受ccm3调控从而影响内皮细胞的功能。根据
harmonizome数据库分析，ccm3是klf4可能的靶基因，gata3可能调控ccm3和atpif1，并且gata3和klf4也存在相互调节，因此gata3也可能是参与ccm3调控atpif1表达过程中的重要因子。
[0097]
3.5临床指标
[0098]
目前临床上尚缺乏提示脑海绵状血管瘤(ccm)发病机制的生物标志物，为了探究ccm3、p-paxillin和p-fak是否在ccm疾病中发生改变，我们收集了ccm病人及脑血管出血病人(对照组)的脑血管组织标本，通过免疫荧光染色检测脑血管内皮细胞中ccm3、p-paxillin及p-fak的表达。结果发现，与对照组相比，ccm病人血管内皮细胞ccm3的表达显著降低，而其粘着斑连接相关蛋白paxillin和fak的磷酸化水平却显著增强。提示ccm3、p-paxillin及p-fak可作为探索ccm疾病发病机制的临床生物标志物(图5)。
[0099]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。