一种双酚AF半抗原的制备方法及应用与流程

一种双酚af半抗原的制备方法及应用
技术领域
1.本技术涉双酚衍生物检测领域，具体涉及一种双酚af半抗原的制备方法及应用。


背景技术：

2.随着现代工业化进程的推进，大量的化学物质被排放入环境，其中一些化学物质能模拟或干扰内分泌系统并对人类和野生动物的生殖与发育等造成危害，因此被称为“内分泌干扰物”。2012年世界卫生组织已经将70多种化学物质列入内分泌干扰物的范畴，其中的双酚a [学名：2，2-二（4-羟基苯基）丙烷；bisphenol a, bpa]是已被证实的典型内分泌干扰物。在工业上bpa被用来合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料。广泛的应用于食品包装材料、食品贮藏容器以及工业洗涤剂、塑料增塑剂和稳定剂等，并且已经在各种食品和环境基质（如水产品、水体、土壤和沉积物）中都检测到bpa的存在。人类通过摄入被污染的食品而暴露于这类物质中，据报道人体的尿液、血清和母乳中都存在着不同水平的bpa。随着不含bpa商品的需求量不断增加以及相关部门对使用bpa的限制，拥有两个酚环结构的bpa类似物由于其物理、化学性质与bpa类似，出现在人们的视野中。双酚af，又名bpaf，作为bpa的替代物在工业生产中使用。bpaf [学名：2,2'-二(4-羟基苯基)-六氟丙烷）]用于电子纤维、光学纤维的交联剂，制备聚酰亚胺、聚酰胺和聚碳酸酯等时所用的单体。有研究表明，即使在每日允许摄入量的1/1000暴露水平，bpaf依然能对大脑发育和行为产生可测量的危害效应，该研究利用斑马鱼做模式生物，为低剂量的bpaf不利于大脑发育并引起多动症的有关机制提供了证据。还有文献表明，微量的bpaf会诱导乳腺癌细胞、前列腺细胞增殖，降低学习记忆能力而且不可恢复。同时，相关研究也证实，bpaf同样具有不弱于bpa的雌激素活性，还具有较强的抗雄性激素活性，与雌激素受体结合，产生类雌激素效应，有研究表明水体中微量的双酚af会对雄性斑马鱼的甲状腺组织和激素水平产生影响，因此bpaf作为bpa替代物的产品也不能消除健康风险。通过与含bpaf的食品包装材料或日用品接触以及从被污染的土壤、空气和水等发生迁移，bpaf可以迁移并富集到包装的食品以及食品原材料中。现有研究表明，bpa及其类似物bpaf在各类食物中广泛存在，浓度水平多为μg/kg水平。
[0003]
因此对食物中bpaf的污染水平进行准确测定对于监测bpaf对人群健康风险是非常必要的。当前关于食品中bpaf测定的主要前处理方法有液-液萃取法、固相萃取法等，液相色谱串联质谱或气相色谱质谱法检测。
[0004]
专利cn102692474a公开了一种食品中双酚af的快速检测方法，其是以离子液体为萃取剂，之后分离得到萃取液后进行hplc的定量分析，但是该方法的灵敏度低，适用的食品种类少。而且离子液体作为萃取液，会极大提升检测的成本，并不经济，不利于产业化。
[0005]
由于食品样品成分复杂，以上的净化方法选择性差、操作繁琐，针对不同的食品样品常需要多种净化手段才可达到检测目的，净化效果也直接影响测定方法的灵敏度和准确度。因此有必要利用抗原-抗体的特异性结合反应，开发净化效果卓越的免疫亲和色谱技术。抗体是免疫亲和色谱技术和免疫分析方法的关键试剂。直接决定分离净化效果和分析方法的特异性和灵敏度等。专利cn109425734a公开了一种双酚a及其类似物的半抗原，其中
化合物作为双酚af的半抗原，用于制备免疫亲和柱。但用于检测双酚af，特别是在复杂基质中双酚af，检测限还比较高，比如对于食品中痕量的双酚af，结果还不能令人满意。


技术实现要素：

[0006]
目前还缺乏特异性强，灵敏度高的bpaf单克隆抗体，严重制约bpaf免疫亲和色谱技术的开发。本发明提供了一种bpaf半抗原和抗原的制备方法，以此结构制备的半抗原和抗原得到的单克隆抗体，特异性强、灵敏度高，经过试验验证，可以适用于12种复杂食品样品中bpaf的净化和富集，结合超高效液相色谱串联质谱检测技术，可对食品中痕量的bpaf进行快速、准确的测定。
[0007]
本发明首先提供了一种双酚af半抗原，结构如下式(i)所示： （i）。
[0008]
本发明还提供了所述双酚af半抗原的制备方法，合成路线如下：
。
[0009]
进一步地，所述双酚af半抗原的制备方法，包括以下步骤：(s1)将双酚af用氢化钠处理后，加入4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯，反应结束后，萃取，层析柱纯化得中间体；(s2)所得中间体先在碱性条件下进行水解，再用酸调节至酸性，反应结束后萃取，干燥即得。
[0010]
进一步地，步骤(s1)中，双酚af和4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯的摩尔比为1:1-1.2。
[0011]
进一步地，步骤(s1)中，所述氢化钠处理是双酚af用氢化钠处理是将双酚af溶于dmf后，冰浴条件下加入氢化钠，待不再有气泡冒出时撤去冰浴，在15-30℃反应0.5-1h，双酚af 和氢化钠的摩尔比为1：1.1-2。
[0012]
进一步地，步骤(s1)中，所述萃取是反应液加入到水中，再用加入乙酸乙酯萃取，萃取操作重复1-2次。层析柱纯化的操作和条件为本领域所熟知，在一个具体实施方式中，样品上样硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯按照体积比1-2:1-2的混合溶剂作为淋洗剂，收集目标产物，旋干溶剂即得中间体。
[0013]
进一步地，步骤(s2)中，碱性条件是加入碱，所述碱为氢氧化钠，氢氧化钾中的至少一种，碱的加入量是中间体的1.5-2倍当量。所述调节ph为酸性是调节ph为2-3，酸为盐酸、硫酸中的至少一种。所述萃取是加入乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃中的至少一种进行萃取。
[0014]
本发明还提供了一种双酚af人工抗原，是以式(i)所述的双酚af半抗原经过活化后，和载体蛋白偶联，经过透析、离心得到，所述双酚af人工抗原如下式(ii)所示：
ꢀ
(ii)。
[0015]
进一步地，所述活化是加入edc和nhs，在15-25℃，避光条件下活化15-30h；所述半抗原、edc和nhs的摩尔比为1：2-3：2-3。
[0016]
进一步地，所述双酚af半抗和载体蛋白的摩尔比为10-30:1，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲状腺蛋白、血匙蓝蛋白或卵清蛋白。偶联反应条件是温度15-25℃，ph为6-8，反应时间12-24h。
[0017]
进一步地，所述双酚af人工抗原的偶联比为6-9，优选7-8，最优选7.3-7.5。
[0018]
本发明还提供了一种双酚af单克隆抗体，是上述式(ii)所示的双酚af人工抗原免疫动物，抗血清筛选，细胞融合和筛选，细胞克隆，纯化后得到bpaf单克隆抗体。
[0019]
单克隆抗体的制备工艺为本领域所熟知，在本发明一个具体实施方式中，所述抗血清筛选和细胞筛选采用间接竞争elisa法，采用方阵滴定法确定包被原、抗体的适合工作浓度；细胞克隆采用有限稀释法；单克隆抗体采用体内诱生腹水法；单克隆抗体纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法。
[0020]
所述动物选自选自balb/c小鼠。
[0021]
本发明还提供了一种免疫亲和柱，通过包括以下步骤制备方法得到：制备活化基质，活化基质和双酚af单克隆抗体偶联，洗涤，装柱。
[0022]
进一步地，所述免疫亲和柱的填料中活化基质和单克隆抗体体积比为1:1-1.5。所述活化基质为nhs活化的琼脂糖凝胶，比如nhs活化的琼脂糖凝胶4b，nhs活化的琼脂糖凝胶6b，活化基质与双酚af单克隆抗体偶联反应条件是是在ph8-10缓冲溶液中，37
±
1℃反应。
[0023]
本发明还提供了一种检测痕量双酚af的方法，包括以下步骤：待测样品经过前处理后，进行上述免疫亲和柱的净化，净化样品用uplc-ms/ms法检测。
[0024]
所述前处理是用有机溶剂将均质后待测样品中的待测物超声提取后，经过离心，取上层有机相，氮气将其吹干后，用磷酸盐缓冲液和甲醇混合液重新溶解。
[0025]
所述样品包括食品，比如包括谷类、豆类、薯类、肉类、蛋类、水产类、乳类、蔬菜类、水果类、糖类、饮料类和酒水。
[0026]
相对于现有技术，本发明取得了以下有益效果：一、本发明制备得了一种新型的双酚af半抗原，在双酚af结构的基础上进行改造，构建含1个苯环和2个苯环上取代的甲基作为间隔臂，增加了支链数量，保持适当的空间位阻，保证了空间结构的复杂性，使机体免疫细胞能够充分识别半抗原结构。动物免疫后结果
显示，该半抗原结构偶联蛋白后制得的抗原进行免疫，更易于诱导产生亲和力和灵敏度俱佳的单克隆抗体。将该性能优异的单克隆抗体用于制备免疫亲和柱，高效净化12类不同食品中的双酚af，配合超高效液相色谱串联质谱进行检测，建立快速、灵敏度高、精密度好和净化效果卓越的痕量检测方法。出乎意料地发现，以本发明双酚af半抗原，制备人工抗原，单克隆抗体，最终制备得到的免疫亲和柱用于双酚af的检测，灵敏度和准确性高，lod和loq低，可以用于复杂基质，比如食品中特异性地痕量双酚af的快速、准确的检测。发明人还尝试了其他结构的双酚af半抗原，但检测结果不如式(i)所示双酚af半抗原。证明本发明式(i)半抗原结构中苯环上的两个甲基对于提高检测灵敏性和准确性有明显的提升作用，而这种作为在苯环上单甲基取代的半抗原和其他取代基的半抗原中未发现。
[0027]
二、本发明的双酚af半抗原制备方法简单，原料价廉易得，是一种适合工业化制备免疫亲和柱的半抗原化合物。
附图说明
[0028]
图1是本发明制得双酚af半抗原式(i)化合物的质谱谱；图2是本发明制得双酚af半抗原式(i)化合物的氢谱图；图3是双酚af载体蛋白bsa的maldi-tof测定图；图4是双酚af人工抗原的maldi-tof测定图。
具体实施方式
[0029]
实施例1：bpaf半抗原的制备步骤如下：将100 mmol的bpaf加入50 ml圆底烧瓶中，加入10 ml的dmf，磁力搅拌使其充分溶解，冰浴下分三次加入200 mmol的氢化钠，待不再有气泡冒出时撤去冰浴，常温反应40 min。缓慢加入100 mmol的4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯，薄层色谱监测反应进程。将反应液缓慢加入20 ml纯水中，用25 ml乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复萃取一次。合并有机相，将有机相旋蒸干，加入12 ml乙酸乙酯将旋干物溶解，称量旋干物3倍重量的硅胶加入其中，旋蒸干，准备将其上样。称量旋干物重量30倍硅胶装柱，上样后，用50 ml淋洗剂（石油醚/乙酸乙酯）进行淋洗，10 ml离心管收集淋洗液，薄层色谱点板收集含有目标产物的淋洗液。将淋洗液旋蒸干后，产物使用减重法称重，用10 ml甲醇溶解，按2倍当量加入2 mol/l naoh溶液，40℃进行反应，薄层色谱监测水解情况。水解完全后，用6 mol/l的hcl调节ph到2。将反应液用50 ml乙酸乙酯萃取两次。分别将萃取的水相和有机相用薄层色谱点板，确定水相中无目标产物后，向收集的有机相中加入5 g无水硫酸钠，加入后磁力搅拌1 h。过滤，旋蒸干，用甲醇溶解备用。
[0030]
合成的半抗原采用lc-ms/ms进行鉴定。取半抗原的甲醇复溶液用电喷雾电离负离子模式下进行扫描，得到图1所示的半抗原质谱图。图2是制备得到bpaf半抗原的氢谱，溶剂cdcl3。bpaf半抗原的分子式为c
23h16
f6o4，分子量470.37，[m-h]-为469.09，与图1的ms鉴定图以及和图2的氢谱结果一致，表明本发明式(i)所示的双酚af半抗原合成成功。
[0031]
实施例2 式(ii)所示的bpaf人工抗原的制备
ꢀ
(ii)a）取式(i)结构式的bpaf半抗原44.8 mmol溶于1 ml dmf中，分别加入134.3 mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和134.3 mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，常温下搅拌2h，制得活化液i；b)取载体蛋白bsa（50 mg）或klh（50 mg）充分溶解于5 ml ph 7.4 的磷酸盐缓冲液中制得反应液ii，将活化液i逐滴缓慢加入反应液ii中，并于室温下搅拌2 h；c）将反应终产物装入透析袋，用0.01 mol/l的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液以除去未反应的小分子物质；d）以10000 rpm离心10 min，收集上清液分装后于-20℃保存备用。
[0032]
2.2 人工抗原的表征用maldi-tof测定与bsa偶联后抗原的偶联比。从图3和图4中分别读出偶联物和bsa分子离子峰的分子量a和b，按下列公式计算偶联比:偶联比=（a-b）/半抗原分子量由图3和图4可知，各种抗原的maldi-tof质谱峰的质荷比与bsa相比，均比bsa大，说明改造结构后的半抗原成功与bsa偶联导致质荷比增大，抗原合成成功。经计算得出，bpaf抗原的偶联比为7.32，为后续的免疫工作打下良好基础。
[0033]
实施例3 bpaf单克隆抗体的制备bpaf单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1）采用实施例2制得的式(ii)bpaf人工抗原免疫动物；2）抗血清筛选，选取血清效价高的动物用作制备单克隆抗体；3)细胞融合和筛选，细胞融合后，筛选效价高的阳性细胞；4）进行细胞克隆，纯化后得到bpaf单克隆抗体。
[0034]
3.1 动物免疫免疫程序采用一次基础免疫加2~3次加强免疫。首次免疫时，用完全佐剂进行乳化抗原，颈背部多点注射免疫，间隔21天，用弗氏不完全佐剂乳化抗原，颈背部多点注射，进行加强免疫。第3次免疫后第8天断尾采血，分离血清。间接/直接elisa法检测免疫效果。
[0035]
3.2 抗血清筛选第3次免疫之后7~10天，于小鼠眼眶下静脉采血200 μl，采集的血液4℃静置2 h后，37℃孵育8 h，血液完全凝固，血清析出。采用间接elisa法筛选包被原稀释度以及抗血清的稀释度，再采用间接竞争elisa法测定其特异性。采用方阵滴定法确定包被原、抗体的最适工作浓度，具体步骤如下：
（1）包被：用包被液将包被原稀释成一系列浓度加至酶标板，100 μl/孔，4℃孵育过夜；按照上述制备bpaf人工抗原相同的方法制备bpaf包被原，只替换载体蛋白为ova；（2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗一遍，280 μl/孔，在吸水纸上拍干；（3）封闭：加入封闭液150 μl/孔，37℃孵育1 h，倾去孔内液体后直接拍干；（4）加样：加入稀释成一系列浓度的待检血清，100 μl/孔，37℃孵育30 min；（5）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗4遍，280 μl/孔，在吸水纸上拍干；（6）加酶：加入hrp-羊抗鼠igg（1:5000倍稀释）100 μl/孔，37℃孵育30min；洗板同（5）；（7）显色：加入新鲜配置的tmb溶液，100 μl/孔，避光37℃显色15min；（8）终止：加入2 mol/l h2so4，50μl/孔；（9）测定：用酶标仪读取各孔od
450nm
（双波长，630 nm为参考滤光片波长）。
[0036]
间接竞争elisa方法如下：（1）包被：用包被液将包被原适当稀释后加至酶标板，100 μl/孔，4℃孵育过夜；（2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗一遍，280 μl/孔，在吸水纸上拍干；（3）封闭：加入封闭液150 μl/孔，37℃孵育1 h，倾去孔内液体后直接拍干；（4）加样：加入不同浓度的bpaf标准品和对应稀释度的抗血清，50 μl/孔，37℃孵育30 min；（5）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗4遍，280 μl/孔，在吸水纸上拍干；（6）加酶：加入hrp-羊抗鼠igg（1:5000倍稀释）100 μl/孔，37℃孵育30 min；洗板同（5）；（7）显色：加入新鲜配置的tmb溶液，100 μl/孔，避光37℃显色15 min；（8）终止：加入2 mol/l h2so4，50 μl/孔；（9）测定：用酶标仪读取各孔od
450nm
（双波长，630nm为参考滤光片波长），以od值为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，用软件origin8.5绘制标准曲线，得到ic
50
（半数抑制浓度）值。根据间接elisa和间接竞争elisa的结果。选取抑制较好，血清效价高的小鼠用作制备单克隆抗体。
[0037]
3.3 骨髓瘤细胞的复苏和培养将骨髓瘤细胞从液氮罐中取出，迅速放入37 ℃水浴中，待完全融化后，将细胞悬液移至15 ml的离心管中，缓慢加入细胞培养液，边加边混合，1000 rpm离心4 min。弃去上清液，将沉淀细胞移至细胞瓶中，加入dmem完全培养液，置于co2培养箱中培养，由于冻存液中含有dmso，复苏后培养液中仍有残余，应于复苏后第二天及时换液。复苏后的骨髓瘤细胞用含有20%小牛血清的完全培养液培养，当细胞处于对数生长期时，形态良好的细胞供融合使用。融合时用移液管将细胞从瓶壁上吹下，收集于50 ml离心管中，1000 rpm离心4 min，用不完全培养基清洗细胞2次，用不完全培养基重悬备用。
[0038]
3.4 脾淋巴细胞的制备细胞融合前3天对阳性小鼠加强免疫一次，腹腔注射25 μg抗原，不加佐剂，用灭菌的生理盐水稀释抗原至0.8 ml。融合前，将小鼠摘眼球放血，分离血清，至于-20℃保存，作为抗体阳性对照。
[0039]
（1）将阳性小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精中，约3 min后，放入平皿内移入超
净台；（2）打开腹腔，无菌取出脾脏，放入盛有10 ml不完全培养液的平皿内清洗，剥离脾脏周围的脂肪和结缔组织；（3）将脾脏移入另一个盛有10 ml不完全培养液的平皿中的200目滤网上，将脾脏剪碎，用高压灭菌的玻璃注射器内芯在滤网上研磨脾脏，再用不完全培养液冲洗滤网，直到滤网上仅剩下白色结缔组织；（4）将脾细胞悬液转移至50 ml离心管中，加不完全培养液至35 ml，混匀。1000 rpm离心10 min，弃上清，用不完全培养液清洗细胞1-2次，进一步除去细胞悬液中的结缔组织；（5）10 ml不完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞计数后备用。
[0040]
3.5 细胞融合（1）分别吸取含1
×
108个脾淋巴细胞和含2
×
107个骨髓瘤细胞的细胞悬液，混合于50ml离心管中，补加不完全培养液至35 ml。1000 rpm离心6min，弃上清。
[0041]
（2）加不完全培养液使细胞悬浮，补加不完全培养液至35 ml，1000 rpm离心6 min，弃上清。将离心管倒置，用吸水纸将残留的液体吸干。
[0042]
（3）用手弹离心管管底，使沉淀细胞呈均匀松散状，置于37℃水中预热；（4）取分装好的37℃预热的50%peg一管，左手匀速转动离心管，右手持1 ml移液管吸取50%peg 0.8 ml，沿管壁缓缓加入，1 min内加完，静置1.5 min;（5）3 min内将5 ml预热的不完全培养液加到融合管中，终止反应；（6）800 rpm离心7 min，弃上清，加入5 ml hat培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，再补加hat培养液至总体积约为70 ml；（7）将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，镜检，置37℃含5% co2的细胞培养箱中培养；（8）每天观察并记录细胞生长情况，融合后第5天用hat培养液换液。
[0043]
3.6 杂交瘤细胞的筛选融合后一周，对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，首先采用间接elisa筛选效价高的阳性细胞。向已经包被封闭好的酶标板的每孔中加灭菌的pbs，50 μl/孔，再加入杂交瘤细胞上清液，50 μl/孔，然后按照间接elisa的步骤进行操作，选出od
450 nm
》1的细胞孔，采用间接竞争elisa检测这些孔的细胞分泌的抗体是否对bpaf具有特异性。
[0044]
3.7 阳性杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法进行细胞克隆，具体操作如下：（1）克隆化的前一天制备饲养细胞；（2）将待克隆的阳性孔中的细胞悬浮，吸取悬浮液至含有1 ml ht培养液的无菌瓶中；（3）细胞悬液台盼蓝染色计数；根据计数结果，用ht培养基进行稀释；（4）细胞培养板置于37℃ 5%co2的培养箱培养7-10天，当克隆细胞长至孔底面积的1/4~1/3时，对其上清液按照3.6的方法步骤进行检测；（5）取阳性克隆扩大培养、冻存，同时按照上述方法继续克隆至阳性率100%；（6）将阳性单克隆细胞扩大培养至24孔板，长满后扩至细胞瓶，一部分冻存；一部
分继续培养，用于生产腹水，制备单克隆抗体。
[0045]
3.8 杂交瘤细胞的冻存（1）将预备冻存的细胞用不完全培养基洗两遍，然后从瓶壁上吹下，移入离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清；（2）根据细胞量的多少，加入1.5~2 ml冻存液悬浮细胞，然后转移到冻存管中；（3）把做好标记的冻存管置于4℃冰箱中0.5~1 h后，移入-80冰箱中24 h，然后移入到液氮罐中保存。
[0046]
3.9 杂交瘤细胞的复苏（1）从液氮管中取出准备复苏的细胞冻存管，迅速投入到37℃水浴中，不断搅动，使其在1 min溶解，在超净台中转移至离心管中，室温，1000 rpm离心4 min；（2）弃去上清，加入完全培养液，轻轻吹打使细胞悬浮，转移至细胞培养瓶中；（3）做好标记，将细胞瓶置于37℃，5% co2的恒温培养箱中培养，过夜后换液，继续培养备用。
[0047]
3.10体内诱生腹水法制备单克隆抗体（1）选用健康的balb/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前1~2周，先给小鼠腹腔内注射无菌石蜡油0.5 ml。预处理过的小鼠2~3个月内均可使用；（2）将生长良好的杂交瘤细胞，1000 rpm离心4 min，重悬，调整细胞密度10
3 /ml个细胞，每只小鼠腹腔注射0.5 ml细胞悬液；（3）接种细胞10天后，可见小鼠腹部膨大，从腹腔抽取腹水，抬高小鼠头部，消毒腹部皮肤，用5 ml注射器刺入腹腔，一般每次可抽取5~10ml。此后每隔1~3天取一次；（4）3000 rpm离心10 min，吸取上层淡黄色腹水，分装，-20℃备用。
[0048]
3.11 单克隆抗体的纯化具体步骤如下：（1）取腹水5ml，加入10 ml 0.06 mol/l，ph 5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/l hcl调节ph至4.8；（2）室温搅拌条件下，逐渐加入160 μl辛酸，4℃静置2 h，8000 rpm离心10 min，弃沉淀；（3）上清中加入0.2 ml 0.1 mol/l pbs，用1 mol/l naoh调节ph至7.4；（4）逐滴加入适量饱和硫酸铵使溶液呈45%饱和度，静置1 h，4 ℃8000 rpm离心30 min，弃上清；（5）沉淀溶于5 ml的pbs中，在pbs中透析2天得到单克隆抗体。
[0049]
采用紫外吸收法测定抗体的浓度。用pbs作空白对照，紫外分光光度计测定蛋白溶液的od
280 nm
、od
260 nm
，然后按下列公式计算抗体浓度：抗体浓度（mg/ml）=1.45
×
od
280 nm-0.74
×
od
260 nm
间接elisa和间接竞争elsia分别测定抗体的效价和ic
50
值。此外，检测获得的抗体与其他结构类似物的交叉反应率，以评价抗体的特异性。按下列公式计算交叉反应率： 交叉反应率（%）=[（ic
50 (bpaf)/ic
50 (竞争物）]
×
100%经测定，bpaf的浓度为3.21 mg/ml，ic
50
为0.62 ng/ml，与bpa、bpb、bps、bpaf的交叉反应率分别为0.05%、0.03%、0.02%、0.04%。表明本发明制得的双酚af单克隆抗体的灵敏度高，特异性好。
[0050]
实施例4 免疫亲和柱的制备基质制备（1）上下混匀n-羟基琥珀酰亚胺活化的sepharose 4b，用1ml移液器（将枪头口稍剪粗）取2 ml柱料（nhs活化的sepharose 4b），加到6 ml反应管中，待自然沉降后体积为1 ml柱床体积。
[0051]
（2）重力作用下流出柱料中的保存液（异丙醇），用10 ml预冷的1 mmol/l hcl洗掉柱床中的异丙醇。
[0052]
（3）加5 ml的偶联缓冲液至柱料中，迅速用注射器从反应管的流出口抽吸走液体。
[0053]
偶联（1）反应管底端封口，将经纯化后mabs混合溶液（bpaf的单克隆抗体量为0.2 mg）加入到反应管中，盖好上盖，上下混匀柱料及溶液。
[0054]
（2）室温条件下采用end-over-end的方式充分混匀上述混和物偶联反应2 h。
[0055]
（3）打开下盖，使柱管内液体自然沉降后，收集流出液，用nanodrop 2000测定od
280nm
测有无igg流出柱管。若280 nm处无峰，可以认为抗体都偶联到柱料上，若280 nm有峰，根据浓度折算柱料上偶联的抗体量。
[0056]
（4）5 ml偶联缓冲液洗涤至无液滴流出后，加3 ml封闭缓冲液，室温下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物反应2 h。
[0057]
（5）反应结束后将柱中液体流干。分别用3 ml 0.1 mol/l tris-hcl和3 ml 0.1 mol/l醋酸/醋酸钠缓冲液依次洗涤。如此循环洗柱三次后，用10 ml 0.02 mol/l pbs洗涤。
[0058]
（6）加入2 ml含0.05% nan3的0.02 mol/l pbs缓冲液于4℃下保存柱料，备用。
[0059]
装柱偶联抗体的柱料用0.02 mol/l pbs洗涤后，将偶联抗体的柱料混匀后装到含下筛板的3 ml固相萃取空柱中，特别注意装入柱料后不可盖上筛板。
[0060]
偶联率的测定抗体和nhs活化的sepharose 4b偶联后，收集偶联后的流出液，测定其中的抗体浓度，计算偶联率。
[0061]
按以下公式计算偶联率：偶联率（%）=[（偶联前抗体浓度-偶联后抗体浓度）
×
流出液体积]/偶联前抗体量
×
100%经测定，bpaf单克隆抗体和活化的sepharose 4b偶联率为99.2%。
[0062]
柱容量的测定将bpaf免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，恢复至室温，用6 ml pbs过柱后，将含bpaf标准品2000 ng的10 ml甲醇-pbs（10：90，v/v）溶液以1 ml/min的速度加到免疫亲和柱上，依次用9 ml pbs和9 ml水洗涤，抽干柱中液体，用3 ml甲醇洗脱，自然重力流出，收集洗脱液。iac柱依次用9 ml水和9 ml 0.02 mol/l pbs洗涤再生，加入2 ml含0.05% nan3的0.02 mol/l pbs缓冲液于4℃下保存。洗脱液经氮气吹干，1 ml甲醇-水（50：50，v/v）复溶，9000 rpm离心10 min后，取上清800 μl于进样小瓶中，超高效液相色谱串联质谱检测。
[0063]
按以下公式计算柱容量：柱容量（ng）=bpaf浓度（ng/ml）
×
体积（ml）
经测定，bpaf免疫亲和柱的柱容量为380 ng。
[0064]
纯溶剂下加标回收率将bpaf免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，恢复至室温，用6 ml pbs过柱后，将含bpaf标准品10 ng的10 ml甲醇-pbs（10：90，v/v）溶液以1 ml/min的速度加到免疫亲和柱上，其余步骤同6.2。计算回收率。
[0065]
经测定，免疫亲和柱对bpaf的回收率为99.7%。
[0066]
重复使用性将新制备的bpaf免疫亲和柱按照6.2和6.3所述的方法对复合iac柱的重复使用性进行验证。每隔3天测定一次柱容量与回收率，连续测定11次。观察柱容量和回收率的变化。
[0067]
经测定，经过11次连续使用后，免疫亲和柱的柱容量下降了约15%，回收率无明显变化，均在95%以上。
[0068]
稳定性将新制备的bpaf免疫亲和柱保存于4℃下，按照6.2和6.3所述的方法分别于保存1、2、4、6、8、10和12个月后对免疫亲和柱的柱容量和回收率进行测定。
[0069]
经测定，免疫亲和柱在4℃下保存12个月后，仍可保持初始柱容量的90%，回收率也大于90%。说明免疫亲和柱在4℃下稳定性良好，至少可保存一年。
[0070]
应用例免疫亲和柱在检测食品中bpaf的应用样品前处理食品包括谷类、豆类、薯类、肉类、蛋类、水产类、乳类、蔬菜类、水果类、糖类、饮料类和酒水类等。由于样品的种类繁多，所以在每类样品中挑选一种代表性样品用于开发免疫亲和净化-超高效液相色谱串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，uplc-ms/ms）方法。因此，选用面粉、豆腐、马铃薯、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、牛奶、菠菜、苹果、白糖、可乐和啤酒等共12种样品。
[0071]
对于动物源性样品（鸡肉、鱼肉、鸡蛋和牛奶），均质后准确称取1.00（
±
0.01）g于离心管中，加入5 ml乙腈涡旋混匀1 min后，超声提取20 min，9000 rpm离心5 min，转移上清于另一离心管中，加入3 ml pbs，混匀后将离心管置于-20℃下1 h，可见出现明显的分层现象，上层为乙腈层、下层为水相层、中间有脂肪析出，用移液器将乙腈层取出，40℃下氮气缓慢吹干，用10 ml甲醇和pbs混合液（10:90，v/v）重新溶解，振荡1 min混匀，准备免疫亲和柱净化。
[0072]
对于植物源性样品（马铃薯、苹果、豆腐、白糖、菠菜和面粉），均质后准确称取1.00（
±
0.01）g于离心管中，加入5 ml乙腈涡旋混匀1 min后，超声提取20 min，9000 rpm离心5 min，转移上清于另一离心管中，按照上述步骤用5 ml乙腈重复提取一次，合并上清液。40℃下氮气缓慢吹干，用10 ml甲醇和pbs混合液（10:90，v/v）重新溶解，振荡1 min混匀，准备免疫亲和柱净化。
[0073]
对于酒水、饮料样品（可乐和啤酒），先将其超声脱气30 min，取4 ml可乐或啤酒，与12 ml pbs混匀后，用1 mol/l的氢氧化钠溶液调节ph到8.5，准备免疫亲和柱净化。
[0074]
免疫亲和柱在使用前从4℃中取出恢复至室温，自然重力下流出保存液，6 ml pbs过柱后，待净化液iac柱上样后，分别用9 ml pbs和9 ml超纯水洗涤，将免疫亲和柱抽干后，用3 ml甲醇洗脱。收集洗脱液，40℃下氮气缓慢吹干，用1 ml甲醇和水混合液（30:70，v/v）
重新溶解，振荡1min后，9000rpm离心5min，取上层液体800μl于进样小瓶中待uplc-ms/ms法检测。
[0075]
uplc-ms/ms检测方法uplc条件：色谱柱为watersacquitybehc18色谱柱（1.7
µ
m,2.1
×
100mm）；柱温为40℃；流动相为（a）甲醇和（b）超纯水；洗脱梯度程序为：0~6min，a：30%线性升至100%；保持2min，8~8.1min，a：100%线性下降至30%，平衡2min；流速为0.3ml/min；进样体积为5μl。
[0076]
ms/ms条件：多反应监测模式；离子源为电喷雾电离，负离子模式；雾化气流速为3l/min；加热气和干燥气的流速均为10l/min；接口温度、脱溶剂线温度和加热块温度分别为300℃、250℃和400℃。bpaf母离子为m/z335.1，子离子为m/z265.0和m/z197.0，定量离子为m/z265.0。
[0077]
标准曲线的建立取空白样品按前述方法进行前处理，在洗脱液氮气吹干后，用不同浓度的标准溶液复溶，配制7个不同浓度的基质标准溶液。分别将每个浓度的溶剂标液和基质标液用uplc-ms/ms进样，每份标准溶液进样三次，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，分别建立溶剂标准曲线和基质标准曲线。比较两条标准曲线的斜率，评估基质效应。基质效应的计算如下：基质效应（%）=（基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线-1）
×
100%如果基质效应大于0，则代表基质增强；如基质效应小于0，则代表基质抑制；基质效应处于-20%~20%，则可认为无基质效应。
[0078]
如表1所示，bpaf在12种食品中的基质效应为-7.8%~1.2%，表明免疫亲和柱的净化效果良好。lod为0.004~0.015μg/kg，loq为0.013~0.050μg/kg，表明方法的灵敏度高。同等浓度下的双酚af在质谱上响应值和信噪比要比双酚f的要高，所以双酚af的检测限也比双酚f要低。
[0079]
方法学验证采用在空白样品中进行添加来测定方法的检出限（limitofdetection,lod）、定量限（limitofquantification,loq）、线性范围、不同添加浓度下的回收率和精密度等。
[0080]
向空白样品中添加不同浓度的标液，按照前述样品前处理的方法处理，uplc-ms/ms检测，比较与空白样品的测量信号，将信噪比（signal/noise,s/n）=3和s/n=10时的加标浓度分别定义为方法lod和loq。设立低、中、高3个加标水平，每个加标水平设立6个平行，连续3天重复样品处理和测定其回收率，计算日内和日间相对标准偏差（relativestandarddeviation,rsd），用于评价方法的日内和日间精密度。
[0081]
表2中rsda%/b%分别表示日内和日间rsd，由表2可知，在不同样品中bpaf的回收率均在80%~120%之间，日内和日间rsd均低于10%，表明回收率和精密度良好。
[0082]
表-1bpaf在各种食品中的线性范围、基质效应、lod和loq
表-2不同样品中bpaf的回收率（n=6）和精密度（n=3）表-2（续）不同样品中bpaf的回收率（n=6）和精密度（n=3）表-2（续）不同样品中bpaf的回收率（n=6）和精密度（n=3）对比例发明人还制备了其他化学结构的bpaf半抗原，分别具有如下式(1)、(2)、(3)的化学结构：
ꢀ
(1) (2) （3）采用以上制备的bpaf半抗原(1)、(2)和(3)化合物与载体蛋白偶联，制成抗原，对balb/c小鼠进行免疫，制得的单克隆抗体对bpaf的ic
50
分别为12.6 ng/ml、11.3 ng/ml和34.7 ng/ml，远大于本发明中半抗原结构获得抗体的ic
50 的0.62 ng/ml。表明（1）、（2）和（3）结构的化合物作为半抗原无法制得高灵敏度的bpaf单克隆抗体。
[0083]
发明人还利用相同的连接臂策略，制备得到了其他双酚类的半抗原，比如式(4)所示的双酚a的半抗原，式(5)所示的双酚s的半抗原，式(6)所示的双酚b的半抗原，式(7)所示的双酚f的半抗原。以期望按照相同的策略能够得到其他双酚类似物的性能优异的半抗原化合物，令人意外的是，只有式(7)所示的双酚f的半抗原表现出明显提升的优势。也即采用本发明特定的连接臂制备双酚类似物半抗原时，并不适用于全部的双酚类似物，只有双酚f和双酚af按照本发明策略制得的半抗原进行免疫后，可以制备出高亲和力和高灵敏度的双酚af单克隆抗体。
[0084]
(4)
(5)(6)(7)。

技术特征：
1.一种双酚af半抗原，其特征在于，结构如下式(i)所示： （i）。2.根据权利要求1所述的双酚af半抗原的制备方法，其特征在于，合成路线如下：。3.根据权利要求2所述的双酚af半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(s1)将双酚af用氢化钠处理后，加入4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯，反应结束后，萃取，层析柱纯化得中间体；(s2)所得中间体先在碱性条件下进行水解，再用酸调节至酸性，反应结束后萃取，干燥即得。4.根据权利要求3所述的双酚af半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(s1)中，双酚af和4-溴甲基-2,6-二甲基苯甲酸甲酯的摩尔比为1:1-1.2。5.根据权利要求3所述的双酚af半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(s1)中，所述氢化钠处理是双酚af用氢化钠处理是将双酚af溶于dmf后，冰浴条件下加入氢化钠，待不再有气泡冒出时撤去冰浴，在15-30℃反应0.5-1h，双酚af 和氢化钠的摩尔比为1：1.1-2；步骤(s1)中，所述萃取是反应液加入到水中，再用加入乙酸乙酯萃取，萃取操作重复1-2次；
层析柱纯化是样品上样硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯按照体积比1-2:1-2的混合溶剂作为淋洗剂，收集目标产物，旋干溶剂即得中间体；步骤(s2)中，碱性条件是加入碱，所述碱为氢氧化钠，氢氧化钾中的至少一种，碱的加入量是中间体的1.5-2倍当量；所述调节ph为酸性是调节ph为2-3，酸为盐酸、硫酸中的至少一种；所述萃取是加入乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃中的至少一种进行萃取。6.一种双酚af人工抗原，是权利要求1所述式(i)的双酚af半抗原经过活化后，和载体蛋白偶联，经过透析、离心得到，所述双酚af人工抗原如下式(ii)所示： (ii)。7.根据权利要求6所述的双酚af人工抗原，其特征在于，所述活化是加入edc和nhs，在15-25℃，避光条件下活化15-30h；所述半抗原、edc和nhs的摩尔比为1：2-3：2-3；所述双酚af半抗和载体蛋白的摩尔比为10-30:1，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲状腺蛋白、血匙蓝蛋白或卵清蛋白；偶联反应条件是温度15-25℃，ph为6-8，反应时间12-24h；所述双酚af人工抗原的偶联比为6-9。8.一种双酚af单克隆抗体，其特征在于，用权利要求6所述式(ii)所示的双酚af人工抗原免疫动物，抗血清筛选，细胞融合和筛选，细胞克隆，纯化后得到bpaf单克隆抗体。9.一种免疫亲和柱，其特征在于，通过包括以下步骤制备方法得到：制备活化基质，活化基质，和权利要求8所述的双酚af单克隆抗体偶联，洗涤，装柱。10.一种检测痕量双酚af的方法，包括以下步骤：待测样品经过前处理后，进行权利要求9所述的免疫亲和柱的净化，净化样品用uplc-ms/ms法检测。

技术总结
一种双酚AF半抗原，结构如下式(I)所示。本发明制备得了一种双酚AF半抗原，动物免疫后结果显示，该半抗原结构偶联蛋白后制得的抗原进行免疫，更易于诱导产生亲和力和灵敏度俱佳的单克隆抗体。将该性能优异的单克隆抗体用于制备免疫亲和柱，高效净化12类不同食品中的双酚AF，配合超高效液相色谱串联质谱进行检测，建立快速、灵敏度高、精密度好和净化效果卓越的痕量检测方法。以本发明双酚AF半抗原最终制备得到的免疫亲和柱用于双酚AF的检测，灵敏度和准确性高，LOD和LOQ低，可以用于复杂基质，比如食品中特异性地痕量双酚AF的快速、准确的检测。（I）。（I）。（I）。


技术研发人员：邵兵 姚凯 张晶 尹杰 杨蕴嘉
受保护的技术使用者：北京市疾病预防控制中心
技术研发日：2022.04.24
技术公布日：2022/5/25