检测阿司匹林对心脑血管病具有保护作用SNP位点的物质及其应用的制作方法

检测阿司匹林对心脑血管病具有保护作用snp位点的物质及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种用于检测snp位点的物质，具体地说是一种用于检测人基因组中cox-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质及其在制备检测服用阿司匹林防治缺血性心脑血管病患者获益的snp位点的应用。


背景技术：

2.2018年《中国心血管报告》显示：随着我国老龄化及城镇化进程的加速，心血管疾病已经成为我国重要的公共卫生问题及首位的死亡原因。阿司匹林是一类性价比较高的抗血小板药物，是二级预防及治疗缺血性心脑血管疾病及外周血管疾病的基石。阿司匹林通过不可逆地乙酰化血小板环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，cox-1）的530位丝氨酸残基，导致cox-1失活，阻断了血小板花生四烯酸(arachidonic acid，aa)生成血栓烷素txa2（thromboxane a2，txa2）途径，抑制了txa2诱导的血小板聚集作用，达到二级预防缺血事件（急性心肌梗死、急性脑梗死、血管性死亡、血运重建、不稳定心绞痛及急性脑缺血发作等）的目的。然而大数据显示阿司匹林二级预防心血管事件，总体有效性仅为25%，因此如何提高阿司匹林治疗的反应性成为提高心血管防治效果的关键点。
3.人群中对药物的应答天然存在着差异性，该研究领域归属于药物基因组学研究范畴，药物基因组学旨在研究个体对药物反应的遗传多态性，包括药物代谢、药物转运、药物作用的靶点蛋白等的多态性对药物应答的影响作用。其中单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，snp）是第三代遗传标志，针对阿司匹林应答差异性相关联snp进行深入研究，是实现对缺血性心血管疾病的个性化治疗及精准防治的需要，也是现代医学发展的趋势。
4.阿司匹林的药代动力学特征如下：即口服阿司匹林肠溶片，经胃肠道吸收后，3～4小时血浆药物浓度水平达到峰值，半衰期仅15～20分钟，其药物代谢主要由肝脏来源于udp-葡萄糖醛酸酶、细胞色素p450 cyp2c9与酰基辅酶a合成酶中间链家庭成员-2等完成。由于阿司匹林不可逆乙酰化血小板cox-1，而成熟血小板无细胞核结构，呈细胞碎片，不具有生成新的cox-1的功能，因此阿司匹林抗血小板作用持续时间为血小板整个生命周期，约7～10天。长期以来，人们对阿司匹林抗药性，即阿司匹林抵抗（aspirin resistance, ar）给予了较多关注。在临床实践中，由于阿司匹林兼具有抗血小板及保护心血管疾病的特征，故有关ar形成了两个概念：即服用阿司匹林后，仍然有缺血性心血管事件的发生，称为临床ar；而服用阿司匹林后，血小板聚集功能得不到有效抑制，称为实验室ar。
5.目前与ar相关联snps的报道，涵盖了阿司匹林药物代谢、药物作用等多个分子。另外由于血小板活化途径存在多样性、交互反应、级联放大等特征，因此血小板活化相应通路分子的snps均有报道与阿司匹林ar抵抗相关联，对于阿司匹林对缺血性心血管病具有保护作用的snps未见报道。
6.目前最常采用诊断及监测ar的基因及snps存在的问题：
1． 被采用的snps大多数是与实验室ar相关联的snps，而实验室ar存在着与临床心血管事件（临床ar）相分离或不一致的现象。
7.2. 种族间的差异性在ar方面，表现的较为明显。目前有关ar关联snps，其数据大多数来自欧洲人种，并不适合中国人种ar基因学诊断及监测。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种服用阿司匹林对心血管病具有保护作用相关联的snp位点。
9.本发明所要解决的次要技术问题在于一种检测上述snp位点的引物组。
10.本发明所要解决的另一技术问题在于一种检测上述snp位点的试剂盒。
11.本发明所要解决的又一技术问题在于一种上述引物组和试剂盒的用途。
12.为了实现上述目的，本发明的发明思路为：发明人针对中国汉族人群，具有缺血性心脑血管疾病，长期服用阿司匹林75mg～100mg/日的患者。（1）利用数据库对亚洲人群cox-1基因上的等位基因频率进行过滤，共挑选出24个在亚洲人种中次等位基因频率相对较高snps位点。（2）设计出24个snps位点的多重pcr引物、采用基因芯片的方法对24个snps进行了克隆、分型。（3）在平均随访5.7（4.8～6.2）年期间，记录了首次发生不良心血管事件的相关事件及时间，内容包括：
①
主要心血管不良事件（major adverse cardiovascular events，mace），包括急性心肌梗死、急性缺血性卒中与血运重建与心血管死亡）。
②
主要心血管不良事件及死亡事件。
③ꢀ
全部心血管不良事件及死亡事件（急性心肌梗死、不稳定心绞痛、急性缺血性卒中、短暂性脑缺血发作、血运重建及死亡等）。（4）将24个snps与心血管事件进行了关联分析，发现cox-1基因中一个与预后关联的snps位点是位于cox-1基因3'-非编码区（3'-untranslated region，3'-utr） 的rs10306190（966c》g），其纯合子突变基因型gg中，不良心血管事件发生显著频率下降，尤其是远期mace发生率下降至0。提示携带该基因位点，阿司匹林能够对心血管事件的保护作用接近100%。
13.本发明采用如下的具体技术方案：检测人基因组中cox-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质在阿司匹林治疗心脑血管疾病预后评估试剂或试剂盒中的应用，其中：所述cox-1基因的rs10306190基因型是cc、cg或gg，其中所述gg基因型的个体服用阿司匹林后对缺血性心脑血管疾病发生保护作用的比例高于其他基因型个体。
14.其中较优地，所述用于检测人基因组cox-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质为如下a）或b）a）用于扩增含有rs10306190在内的基因组dna片段的pcr引物组；b）含有上述引物组的试剂。
15.其中较优地，所述引物组包括四条引物，分别为seq id no.2所示的asp1、seq id no.3所示的asp2、seq id no.4所示的lsp和seq id no.5所示的sta。
16.其中较优地，所述引物组或含有引物组的试剂用于检测含有rs10306190在内的基因组dna片段，所述dna片段如seq id no.1所示。
17.一种用于检测阿司匹林对心脑血管疾病有保护作用的关联snp位点的引物组，所述引物组用于扩增包括人基因组cox-1基因的rs10306190在内的基因组dna片段。
18.其中较优地，所述引物组包括四条引物，分别为seq id no.2所示的asp1、seq id no.3所示的asp2、seq id no.4所示的lsp和seq id no.5所示的sta。
19.一种用于检测阿司匹林对心脑血管疾病有保护作用的关联snp位点的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
20.本发明的有益效果如下：发明人对中国汉族人群中ar关联snps进行了研究。发现在平均随访5.7（4.8～6.2）年期间，证明了一个携带cox-1 基因rs10306190（966c》g）纯合子突变位点为阿司匹林对临床ar具有保护作用的关联snp， 服用阿司匹林期间，与cc cg基因型相比较，携带gg基因型的个体服用阿司匹林后远期恶性不良心血管事件发生概率明显降低，尤其是mace，发生概率接近0，可以实现对临床ar（即缺血性心脑血管疾病）完全保护。该发现最大意义在于：（1）大多数情况下，突变是有害的，而本发明提出的snp位点却是有益的突变。（2）携带该纯合子突变gg基因型的个体，服用阿司匹林后，可以实现对不良心血管事件百分之百的保护。基于上述有益效果，本发明提供了一种可以准确进行阿司匹林治疗缺血性心脑血管疾病保护性作用预后评估的检测引物及检测试剂盒。为阿司匹林的临床应用提供了一种新思路及方法，在一定程度上，实现了对缺血性心脑血管疾病的精准防治以及全程的健康管理。
附图说明
21.图1为snprs10306190（966c》g）分型结果。
具体实施方式
22.为了使本领域技术人员对本案有清楚的了解，下面利用具体实施方式进行详细说明，本具体实施方式所使方法如无特殊说明均为常规方法。
23.实施例1 本发明用于检测cox-1基因3'-utr 的snp位点rs10306190（966c》g）的引物及试剂盒（1） dna序列的名称及结构：cox-1基因又名前列腺素合成酶-1基因（prostaglandin synthetase1，ptgs1），gene id为5742。位于9q32-q33.3，chr9:122,371,024-122,395,703，上游5'-非翻译区（5'-untranslated region，utr）共计1862bp；下游非转录的3'
‑ꢀ
utr共计3157bp，全长24,680 bp，由11个外显子和10个内含子构成， cox-1基因启动子区缺乏tata框，富含gc区域，在体内执行看家基因功能。其中rs10306190（966c》g）位点位于3'-utr ，rs1030619序列信息如seq id no.1所示：seq id no.1：gactttctgctgggatccttgggcccatcactgtatagacatgctaccactggtacttcctttctccctgcgggccaggcactgcccttttcaggaakct[c/g]tcttaaaatacccattgccccagacctggaagatataacattcagttcccaccatctgattaaaacarcttcctcccttacagagcatacaacagagggg。
[0024]
（2）设计24个snps位点的多重pcr引物将设计的24个snps位点的rs号提交fluidigm的d3设计网站，给出指导pcr引物序列，然后订购相关试剂及引物合成。
[0025]
本发明所述的cox-1 基因rs10306190（966c》g）涉及四条引物序列，分别为：asp1 （seq id no.2）：ctggggcaatgggtattttaagag；asp2 （seq id no.3）：ctggggcaatgggtattttaagac；
lsp（seqidno.4）：caggcactgcccttttcagg；sta（seqidno.5）：ggtgggaactgaatgttatatcttcc。
[0026]
其中，sta（seqidno.5）为预扩增上游引物，lsp（seqidno.4）为预扩增下游引物，asp1(seqidno.2)为分型引物1，asp2(seqidno.3)为分型引物2；sta和lsp用于通过预扩增pcr获得cox-1基因3'-utr的rs10306190点上下游序列，asp1和asp2用于鉴定待测个体的rs10306190位点的基因型。
[0027]
本发明所述试剂盒的成分如下：2
×
mμltiplexpcrmastermix(2
×
多重pcr反应混合液)，2
×
assayloadingreagent(2
×
芯片上样缓冲液)，biotium2
×
fastprobemastermix(实时定量pcr反应混合液)及rox染料等。
[0028]
实施例2利用本发明所述引物组和试剂盒进行cox-1基因的rs10306190基因型检测的方法（1）dna提取：dna标本来源来自于人的白细胞。采集患者外周静脉血2ml，置于抗凝管中。应用全基因组dna提取试剂盒(北京天根生化有限公司产品)，按照说明书从1ml外周血中提取白细胞基因组dna，溶解于0.1
×
te缓冲液中(10mmol/ltris-1mmol/ledta，ph8.0)，于-20℃冰箱中储存备用。
[0029]
（2）采用fluidigm公司的纳米级微流体技术进行cox-1基因分型：本研究利用本实验室的biomarkhd微流控芯片基因分析系统，自行购置了fluidigm96
×
96基因分型芯片(dynamicarraychipforgenotyping)，对候选标记位点进行分型。其实验流程是，将待分型样本进行预扩增，以富集需要分型的标记位点上下游200bp区域；将扩增产物稀释并制备samplepre-mix；准备多重分型引物的assay-mix；上机芯片预处理；分别点样samplepre-mix和assay-mix，通过上样仪后，加入芯片反应仓，读取分型荧光信号。
[0030]
具体方法步骤如下表：
①
分装96个dna样本至96孔板，每孔10μl。
[0031]
②
按照如下表1所示，配置10
×
sta(specifictargetamplification)预扩增引物混合液。
[0032]
表1
③
sta预扩增反应体系如表2所示，pcr反应循环为：95℃15min；95℃15s，60℃4min，14个循环；反应结束后按照1:100的比例稀释预扩增产物，-20℃保存待用。
[0033]
表2
④
准备snptypeassaymixes，表3所示。
[0034]
表3
⑤
按下述体系准备10
×
assaymix，表4所示。
[0035]
表4
⑥
按下述体系准备samplemix，表5所示：表5
⑦ꢀ
揭开ifc微流体芯片保护膜，在芯片点样孔中缓慢加入control line fluid，将芯片放置于ifc controller hx仪器上，运行“prime (139
×
)”程序预处理约45 min；取出芯片， 在两个点样孔中分别加入5 μl sample mix，4 μl assay mix，将芯片放置于ifc controller hx仪器上，运行“prime (139
×
)”程序预处理约1.5 h。
[0036]
⑧ꢀ
将预处理结束的ifc芯片放于bio-mark hd仪器上，设置反应程序“snptype 96
×
96 v1”并运行；下机数据利用snp genotyping analysis_20140108.5_v4.1.2软件处理。
[0037]
snprs10306190（966c》g）分型结果如图1所示。实施例3 cox-1基因的rs10306190与服用阿司匹林患者远期心血管事件关联性分析（1）本发明的最佳实施人群：规律服用抗血小板药物阿司匹林75mg～100mg/d，在缺血性心脑血管疾病患者进行二级预防的中国汉族人群。
[0038]
（2）实施例患者一般资料：本发明所涉及的纳入病例2008年4月～2010年7月，来自北京地区军队干休所，规律、全程服用抗血小板药物阿司匹林75mg～100mg/d二级预防缺血性心脑血管疾病患者486例，其中男性334例（68.7%），女性152例（31.3%）。平均年龄73.86
±
8.15（48～92）岁。其余特征如表6所示。
[0039]
（4）方法
①ꢀ
多重pcr引物设计：方法见实施例1记载。
[0040]
②ꢀ
人全血白细胞dna提取：方法见实施例2记载。
[0041]
③ꢀ
cox-1基因snp分型：方法见实施例2记载。
[0042]
④ꢀ
随访及终点事件的定义：所有的患者于2014年12月31日前随访结束。平均随访
5.7（4.8～6.2）年。
[0043]
（5）终点事件：
①ꢀ
主要心血管不良事件（mace）：急性心肌梗死、急性缺血性卒中、心血管死亡与血运重建等。
[0044]
②ꢀ
主要心血管不良事件（mace）及死亡事件：急性心肌梗死、急性缺血性卒中、血运重建与全因死亡等。
[0045]
③ꢀ
全部心血管不良事件及死亡事件：急性心肌梗死、不稳定心绞痛、急性缺血性卒中、短暂性脑缺血发作、血运重建及全因死亡等。
[0046]
（6）统计分析：应用https://www.snpstats.net/start.htm 和http://shesisplus.bio-x.cn/shesis.html在线软件评估基因座位、基因型与结局变量进行关联分析，并计算优势比(or)及95%可信区间(ci)。其余统计方法采用spss统计分析软件。
[0047]
（7）结果
①
实施例患者一般资料、基础临床特征及随访结果：其中随访结果示：在平均随访5.7（4.8～6.2）年期间，
①ꢀ
mace 63例（12.9%），包括：急性心肌梗死22例（34.9%）、急性脑梗死27例（42.9%）、心源性猝死1例（1.6%）和血运重建13例（20.6%）。
②
mace与全因死亡发生率74例（15.2%），包括：急性心肌梗死22例（29.7%）、急性脑梗死27例（36.5%）、死亡12例（16.2%）和血运重建13例（17.6%）。
③
全部心血管不良事件与死亡事件发生157例（32.3%），包括：急性心肌梗死22例（14.0%）、急性脑梗死27例（17.2%）、死亡12例（7.6%）、血运重建13例（8.3%）、心绞痛60例（38.2%）和脑缺血发作23例（14.7%）。其余患者一般特征、基础疾病史、服药史及化验结果见表6。
[0048]
表6实施例患者一般资料及基础临床特征
②ꢀ
cox-1基因24个snps位点基本特征：cox-1基因中，3个snps位于5'-utr（rs1330344、rs1213266和rs10306130），2个snps位于外显子（rs3842788和rs5788），16个snps位于内含子区（rs7866582、rs10985627、rs2282169、rs12555242、rs10306146、rs10306149、rs10306152、rs4273915、rs10306230、rs4836886、rs4836888、rs9299280、rs6478565、rs10306166、rs12551233和rs10306174）和3个snps位于3'-utr（rs8046、rs10306190 和rs10306196）。其中rs1330344的次等位基因频率为在汉族人中0.41，rs10306174次等位基因频率为0，目标rs10306190次等位基因频率为0.09（表7）。
[0049]
表7 cox-1基因24个snps基本特征注：reference sequence（参考序列）；position（基因位置）；allele（基因座位）；maf（次等位基因频率）；h-w（哈-温平衡检验）； call rate（%）：基因扩增率。
[0050]
③
基因座位/基因型与结局变量的单因素相关性分析：
除外rs10306174（该位点次等位基因为0），其余23个snps的基因座位/基因型与远期mace、mace与死亡事件、全部心血管不良事件与死亡事件的相关性分析结果显示：rs10306190突变基因座位及基因型与远期mace、mace与死亡事件、全部心血管不良事件与死亡事件均为负相关（p＜0.05，表8-10）。
④
cox-1基因rs10309190（c/g）与结局变量的相关性（表8-13）：表8cox-1基因23个snps基因座位/基因型与mace单因素相关分析
表9 cox-1基因23个snps基因座位/基因型与mace 死亡事件单因素相关分析
表10 cox-1基因23个snps基因座位/基因型与全部血管事件和死亡事件的单因素相关分析
表11 cox-1 基因rs10309190基因型与mace的相关分析
注：校正年龄，性别，bmi，吸烟，饮酒，运动，他汀，硝酸酯类，ccb，acei/arb等因素表12 cox-1 基因rs10309190基因型与mace 死亡事件的相关分析注：校正年龄，性别，bmi，吸烟，饮酒，运动，他汀，硝酸酯类，ccb，acei/arb等因素表13 cox-1 基因rs10309190基因型与全部心血管事件 死亡事件的相关分析注：校正年龄，性别，bmi，吸烟，饮酒，运动，他汀，硝酸酯类，ccb，acei/arb等因素结论：从上表可知，无论是在共显性模式或隐性模式下，突变gg基因型中远期mace、mace 死亡事件、全部心血管不良事件 死亡事件发生风险均下降（p《0.05%）, 经多因素校正后，携带突变gg基因型，远期血管事件风险下降100%。

技术特征：
1.检测人基因组中cox-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质在阿司匹林治疗心脑血管疾病预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述cox-1基因的rs10306190基因型是cc、cg或gg，其中所述gg基因型的个体服用阿司匹林后对缺血性心脑血管疾病发生保护作用的比例高于其他基因型个体。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测人基因组cox-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质为如下a）或b）a）用于扩增含有rs10306190在内的基因组dna片段的pcr引物组；b）含有上述引物组的试剂。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述引物组包括四条引物，分别为seq id no.2所示的asp1、seq id no.3所示的asp2、seq id no.4所示的lsp和seq id no.5所示的sta。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述引物组或含有引物组的试剂用于检测含有rs10306190在内的基因组dna片段，所述dna片段如seq id no.1所示。5.一种用于检测阿司匹林对心脑血管疾病有保护作用的关联snp位点的引物组，其特征在于：所述引物组用于扩增包括人基因组cox-1基因的rs10306190在内的基因组dna片段。6.如权利要求5所述的引物组，其特征在于：所述引物组包括四条引物，分别为seq id no.2所示的asp1、seq id no.3所示的asp2、seq id no.4所示的lsp和seq id no.5所示的sta。7.一种用于检测阿司匹林对心脑血管疾病有保护作用的关联snp位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求5或6所述引物组。

技术总结
本发明公开了检测人基因组中COX-1基因的rs10306190的多态性或基因型的物质在制备检测阿司匹林对心脑血管患者心血管事件的发生有保护作用的产品中的应用；所述COX-1基因的rs10306190基因型是CC、CG或GG，其中所述GG基因型的个体服用阿司匹林后对缺血性心脑血管疾病发生保护作用高于其他基因型个体。本发明提供了一种可以准确进行阿司匹林治疗缺血性心脑血管疾病预后评估的检测引物及检测试剂盒。本发明为阿司匹林的临床应用扩展提供了一种新思路及方法，在一定程度上实现了对缺血性心脑血管疾病的精准防治以及全程的健康管理。心脑血管疾病的精准防治以及全程的健康管理。心脑血管疾病的精准防治以及全程的健康管理。


技术研发人员：李晓利 王强 王宇哲 胡晓湘 范利 曹剑 肖漓 贾国栋 尹慧君
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第二医学中心
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25