一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，主要涉及一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法。


背景技术：

2.霉菌毒素是真菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，全球每年约有1/4的粮食受到霉菌毒素的污染，造成的经济损失达数千亿美元。粮食作为人类食物中最主要的能量供给原料，其加工品的食用安全问题引起社会广泛关注。目前已知的真菌毒素有300多种，粮食中的真菌毒素常见的有玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)、呕吐毒素(vomitoxin，脱氧雪腐镰刀菌烯醇deoxynivalenol,don)、黄曲霉毒素(aflatoxin，aft)、赭曲霉毒素(ochratoxin，ota)、烟曲霉毒素(fumonisin，fum)等，它们可通过饲料或食品进入人和动物体内导致中枢神经系统、免疫系统、生殖器官等多系统器官的损伤，部分毒素还具有致癌、致畸和致突变的毒害作用。
3.玉米赤霉烯酮(zen)，又常被称作f2毒素，是一种非甾体霉菌毒素，主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)和粉红镰刀菌(fusarium roseum)产生，是目前全世界之中污染范围最为广泛的一种镰刀菌毒素。首先，从赤霉病玉米中分离，玉米赤霉烯酮广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物。玉米赤霉烯酮病毒的结构与动物内源雌激素相似，所以可与始激素受体结合而显示出弱雌激素活性。根据实验表明，该病毒所具有的类雌激素作用有可能导致动物雌激素亢进症，进一步造成动物流产、死胎等生殖机能异常，并且对免疫系统有潜在的毒害作用，还可能会导致免疫抑制、生长下降、不育以及畸形等问题，其中，猪尤其对该病毒最为敏感。
4.粮食在受到玉米赤霉烯酮大范围污染后，不仅严重制约了农业经济，也在全球范围内带来严重的食品安全问题，也威胁到人类身体健康。现在全球已有很多国家制订了食品中关于zen的限量标准，以预防玉米赤霉烯酮对人和动物可能造成的危害。在我国规定，玉米赤霉烯酮在粮食中的含量，必须低于60μg/kg，饲料中zen含量必须低于500μg/kg。
5.目前，玉米赤霉烯酮在食品和饲料中含量的主要有以下几种分析方法：高效液相色谱法(hplc)、薄层色谱法(tlc)、酶联免疫法(elisa)以及液-质联用法(lcms)、胶体金快速定量法等。其中高效液相色谱法(hplc)、薄层色谱法(tlc)、酶联免疫法(elisa)以及液-质联用法(lcms)这四种方法。酶联免疫吸附实验由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐；高效液相色谱法因其对检测样品、仪器及操作人员的要求，不利于基层常规检测使用。
6.胶体金快速定量法是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(hauc14)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下(本发明用的是柠檬酸三钠作为还原剂)，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体
金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、bsa (牛血清白蛋白)等非共价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。
7.胶体金免疫层析法能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析试验法利用抗原抗体反应原理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，结果安全有效，简单方便，且成本较低、耗时较短、更加快捷，能够满足现场快速检测粮食中玉米赤霉烯酮含量，保证粮食的健康与安全，减少粮食污染对人体健康带来的危害。


技术实现要素：

8.本发明旨在针对现有背景技术中存在的不足，而提供的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法。
9.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法。
10.包括以下步骤：
11.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡1～2min，静置，于2000～4000r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；
12.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
13.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从2～8℃的温度中取出，在室温下放置1～2h，直到温度在20～25℃，将孵育器预热至35～45℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
14.发明效益
15.玉米赤霉烯酮毒素广泛存在于小麦、燕麦、大麦等粮食中，是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素。玉米赤霉烯酮污染粮食后，会带来一系列严重的食品安全问题，威胁人体健康。由于玉米赤霉烯酮对人体和动物产生的危害，目前己有很多国家制订了食品中玉米赤霉烯酮的限量标准。澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的质量分数不能超过50μg/kg，我国规定原粮和成品粮包括禾谷、豆类等中玉米赤霉烯酮的质量分数不能超过60μg/kg，因此对于各种粮食中玉米赤霉烯酮含量进行快速、准确地检测是十分必要的。而胶体金快速定量法操作简单，一般在5～10min内就会出结果，同时由于测定结果阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断并且特异性好。因此胶体金快速定量法能够准确有效地测出被测粮食中所
含玉米赤霉烯酮的含量，对于粮食污染的防治起到一定的促进作用，进一步保障了粮食的安全和健康。
16.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
17.对照组
18.(1)样品的处理：称取10.00g样品于100ml离心管中，加入100μl玉米赤霉烯酮同位素内标溶液(1μg/ml)，加入8ml乙腈：水(84：16，v：v)溶液，涡旋1min，超声20min，10000r/min离心5min。收集上清液4ml至多功能净化柱的玻璃管中，加入4ml乙腈混匀，将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，取4ml过柱后的溶液转移至氮吹管中，在40～50℃下氮气吹干，用乙腈-水(10：90,v：v)定容至1ml，涡旋30s，用0.22μm微孔滤膜过滤至进样瓶中，得到待检测的样品。
19.(2)样品的检测：
20.液相色谱条件：色谱柱为：waters acquity uplc beh c
18
液相色谱柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)，流速为0.3ml/min；进样量5μl，柱温30℃；流动相：a：0.05％甲酸；b：乙腈；洗脱梯度0～1.5min，10％b；1.5～6.0min，10％b～70％b；6.0～6.1min，70％b～90％b；6.1～7.0min，90％b；7.0～7.1min，90％b～10％b；7.1～9.0min，10％b。
21.质谱条件：离子源：电喷雾离子源esi /esi-；毛细管电压：esi ：3.0kv，esi-：2.5kv；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流速：150l/h；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800l/h；碰撞气为氩气；碰撞气流量：0.16ml/min；检测方式：多反应离子监测(multiple reaction monitoring,mrm)。
22.实施例1
23.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡1min，静置，于2500r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；
24.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
25.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从4℃的温度中取出，在室温下放置1h，直到温度在20℃，将孵育器预热至38℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
26.实施例2
27.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡1.25min，静置，于3200r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；
28.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得
的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
29.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从5℃的温度中取出，在室温下放置1.5h，直到温度在21℃，将孵育器预热至40℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
30.实施例3
31.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡2min，静置，于3500r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；
32.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
33.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从4～8℃的温度中取出，在室温下放置1.5h，直到温度在23℃，将孵育器预热至42℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
34.实施例4
35.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡2min，静置，于3800r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；
36.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
37.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从4～8℃的温度中取出，在室温下放置2h，直到温度在24℃，将孵育器预热至44℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
38.实施例5
39.(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡2min，静置，于4000r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到
待检测的样品；
40.(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；
41.(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从8℃的温度中取出，在室温下放置2h，直到温度在25℃，将孵育器预热至45℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。
42.选取一种被测粮食进行上述检测，平行测定6次，以下是部分实验结果：
43.表1对照组、各实施例的测定结果
[0044][0045]
根据表1可以得出，五组粮食样品的检测结果，其相对标准偏差(rsd)极小于8％，表明这种通过胶体金快速定量法进行快速检测的方法重现性良好，满足粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量检测的稳定性要求，平行性相对较好。且和液相色谱-串联质谱法所测得的结果相比，两者之间并无明显的差异。
[0046]
选取已知玉米赤霉烯酮毒素含量的被测粮食，平行测定3次，以下是部分实验结果：
[0047]
表2方法检测准确性结果
[0048][0049]
根据表2可以得到，五组粮食样品的检测结果分别为3.17μg/kg、3.15μg/kg、3.18μg/kg、3.16μg/kg、3.24μg/kg，均在标准参考样品要求的标准值范围之内，可见通过胶体金快速定量法进行快速检测的方法检测准确度高，且效果好，检测迅速，可以满足检测需求，且相比液相色谱-串联质谱法所测结果更加准确。
[0050]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)样品的处理：称取10.00g被测粮食样品于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml提取液，用涡旋振荡器振荡1～2min，静置，于2000～4000r/min离心1min，得上清液，取100μl上清液，得到待检测的样品；(2)胶体金试纸条的制备：将zen半抗原通过活泼酯法分别与bsa和ova偶联，得到zen的偶联物zen-bsa和zen-ova，利用zen-bsa作为免疫原制备抗zen的单克隆抗体，将制得的胶体金溶液标记经过透析除盐处理的抗zen的单克隆抗体，并将其喷涂到金标垫上，将zen-ova喷涂到t线，兔抗鼠单克隆抗体喷涂到c线，组装成试纸条，干燥，得到检测所需的胶体金试纸条；(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品从2～8℃的温度中取出，在室温下放置1～2h，直到温度在20～25℃，将孵育器预热至35～45℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μl待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。2.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：步骤(2)所用的胶体金溶液的制备方法为：准确称取99～110g的超纯水于三口瓶中，油浴加热，然后加入0.5ml2％(w/v)的氯金酸溶液，快速搅拌至均匀，待溶液沸腾后一次性地加入1.45ml的1％(w/v)柠檬酸三钠，搅拌30min并回流至溶液颜色由浅黄色变为紫红色，当溶液颜色稳定时，停止加热，继续慢速搅拌20min，自然冷却至室温，制备得到检测所需的胶体金溶液。3.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：步骤(2)所述标记具体为：在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度达到40ug/ml，25℃下孵育5min，用0.1mol/l k2co3调节胶体金溶液的ph为9.0，然后加入10％bsa至bsa的终浓度为0.1％(w/v)，10000rpm离心20min，弃上清液，再用0.01mm ph为9.0的tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的1/10的0.01mm ph为9.0的tris缓冲液中，最后加入10％(w/v)bsa至bsa的终浓度为0.1％，4℃储存备用。4.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：离心机的转速为2500～4000r/min。5.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：干燥为37℃烘箱干燥。6.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：胶体金试纸条、质控样品的冷藏温度为4～8℃。7.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法，其特征在于：孵育器的预热温度为38～45℃。

技术总结
一种快速检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素含量的方法属于检测技术领域，该方法包括以下步骤：(1)称取10.00g被测粮食样品于100mL具塞锥形瓶中，加入20mL提取液，振荡、静置，离心1min，得上清液，取上清液，得到待检测的样品；(2)胶体金试纸条的制备；(3)样品的检测：将胶体金试纸条、质控样品在室温下放置1～2h，直到温度在20～25℃，将孵育器预热至35～45℃，将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔，用微量移液器移取300μL待测溶液，加入到检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖，孵育5min取出试纸条，2min内用胶体金读数仪读取结果，得到被测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。粮食中玉米赤霉烯酮毒素的含量。


技术研发人员：王杰文
受保护的技术使用者：深圳中检联检测有限公司
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25