一种可控杀菌的复合水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于水凝胶制备技术领域，具体涉及一种可控式杀菌的复合水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.感染是慢性伤口的常见问题，也是伤口难以愈合的主要原因之一，而治疗伤口感染常见的办法是利用伤口敷料来避免伤口感染，然而传统辅料会与伤口相互粘连，造成二次伤害，水凝胶敷料则避免这些问题。
3.n-异丙基丙烯酰胺(nipam)水凝胶是一种能在水中溶胀而不溶解的亲水性三维网络结构高分子聚合物材料，是一种具有温度敏感型的智能水凝胶。n-异丙基丙烯酰胺水凝胶的最低临界温度在33℃左右，当温度上升到33℃以上时，nipam水凝胶的性质会发生变化，其体积收缩的同时释放水分。因此，可以将n-异丙基丙烯酰胺水凝胶应用于各种生物医学中，如作为组织工程，药物释放载体，以及生物传感器等。当nipam水凝胶作为药物释放载体时，其在光疗中表现出明显的优势，主要应用于光动力治疗，光热治疗等治疗方法，但单独的nipam水凝胶临界温度在33℃左右，应用比较局限，因此需要引入的第二单体丙烯酰胺(am)来进行调控。
4.光热治疗法又称为光热分解，是指具有较高光热转换效率的光热剂，在易穿透组织的nir照射下，将光能转化为热能通过细胞热消融途径来实现不可逆细胞破坏的一种治疗方法。在光热治疗过程中，光热剂cus因其独特的光热转换效果以及具有独特的光学和电学特性被受到广泛应用。然而单独光热治疗时温度过高反而会导致抑制细胞组织生长，因此在水凝胶光照治疗过程中，需要引入某种药物，利用光热协同的杀菌方式最终达到温和且高效的杀菌，进而达到促进伤口治疗的效果。在杀菌的药物中常见的有盐酸四环素，阿莫西林等抗生素，长期使用会产生耐药性。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种可控式杀菌的复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明中，将光热剂lnfs@cus和n-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰胺共聚合生成光热水凝胶，然后将光热水凝胶干燥并与蜂毒肽溶液混合浸泡最终得到可控式杀菌的复合水凝胶；所述可控式杀菌的复合水凝胶生物相容性好，与细菌相互作用强，可控性好，可在短时间内快速杀死细菌。
6.本发明中首先提供了一种可控式杀菌的复合水凝胶，所述可控式杀菌的复合水凝胶为多孔结构；所述复合水凝胶是在光热剂lnfs@cus、共聚单体n-异丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺复合得到的光热水凝胶上负载杀菌药物蜂毒肽得到。
7.本发明中还提供了上述可控式杀菌的复合水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
8.将n-异丙基丙烯酰胺单体、丙烯酰胺单体和n,n-亚甲基双丙烯酰胺溶于lnfs@cus
水溶液中，超声搅拌至混合均匀，通氮除氧，然后将入过硫酸铵溶液，搅拌均匀后加入n,n,n,n,四甲基乙二胺聚合反应，反应结束后洗涤、干燥，得到光热水凝胶；
9.将光热水凝胶放入蜂毒肽溶液中充分溶胀，得到可控式杀菌的复合水凝胶。
10.进一步的，所述n-异丙基丙烯酰胺单体、丙烯酰胺单体、n,n-亚甲基双丙烯酰胺和lnfs@cus水溶液的用量比为0.09g-0.2g：0.004g-0.006g：0.003g：2-5ml。其中，所述lnfs@cus水溶液的浓度为1mm。
11.进一步的，所述lnfs@cus水溶液、过硫酸铵溶液和n,n,n,n,四甲基乙二胺的体积比为2～5ml:25～50μl:5～15μl。
12.进一步的，所述聚合反应的条件为室温下反应4～6h。
13.进一步的，所述光热水凝胶和蜂毒肽溶液的用量比为0.03～0.05g：5～10ml，蜂毒肽溶液的浓度为2～8μm。
14.进一步的，所述蜂毒肽溶液的制备方法具体为：
15.将蜂毒肽粉末溶于1、1、1、3、3、3-六氟异丙醇中，在室温中振荡混合均匀后干燥，然后将干燥产物与去离子水混合，超声振荡后，得到蜂毒肽溶液。
16.本发明中还提供了上述可控式杀菌的复合水凝胶在光热杀菌中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.本发明中，丙烯酰胺(am)单体的引入增加了n-异丙基丙烯酰胺(nipam)水凝胶的临界温度，使其在储存以及药物释放应用上受温度影响比较小，而光热剂溶菌酶负载的硫化铜纳米粒子的引入，为nipam水凝胶药物释放提供媒介。
19.本发明中，在制备可控式杀菌的复合水凝胶的过程中加入了蜂毒肽。蜂毒肽(mlt)作为最强的抗炎物质之一，具有很强的杀菌效果，将mlt引入到当nipam水凝胶当中，在近红外光照射水凝胶时，光热剂的升温会导致mlt从水凝胶中释放出来，通过控制近红外光的照射时间，或者照射功率从而调控药物的释放速率，最终达到最佳的光热协同杀菌效果。通过这种方法，成功制备了一种负载蜂毒肽的可控式复合水凝胶敷料，该水凝胶敷料与传统光热水凝胶敷料相比，作用比较温和，避免了温度过高而损伤正常细胞组织的缺点同时也避免了传统伤口敷料粘连伤口造成二次伤害的弊端。
附图说明
20.图1为n-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰胺水凝胶(nipam/am hydrogel)的sem图。
21.图2为光热水凝胶(lnfs@cus/nipam/am hydrogel)的sem图。
22.图3中大肠杆菌(a)和可控式杀菌的复合水凝胶红外光照射后的大肠杆菌的(b)sem图。
23.图4为不同蜂毒肽浓度制备的可控式杀菌的复合水凝胶对细菌存活率的影响。
24.图5为可控式杀菌的复合水凝胶在不同功率照射下对细菌存活率的影响。
25.图6为可控式杀菌的复合水凝胶在不同时间照射下对细菌存活率的影响。
具体实施方式
26.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
27.实施例1
28.(1)nipam/am光热水凝胶的制备：
29.称量的0.096gn-异丙基丙烯酰胺单体与0.004g的丙烯酰胺单体，以及0.003g的n,n-亚甲基双丙烯酰胺溶于2ml浓度为1mm lnfs@cus水溶液中，超声搅拌，通入氮气去除溶液中的氧气，然后加入25μl浓度为10％过硫酸铵溶液，搅拌均匀后加入10μl的n,n,n,n,四甲基乙二胺，倒入模具(1cm*1cm*cm)中聚合反应6个小时，聚合反应结束后洗涤、干燥，得到nipam/am光热水凝胶，记为lnfs@cus/nipam/am hydrogel。
30.(2)可控式杀菌的复合水凝胶的制备：
31.通过干态浸泡法将0.03g nipam/am光热水凝胶放在5ml浓度为8μm蜂毒肽溶液中48h，待充分溶胀后取出，放入去离子水中浸泡4h，除去表面的蜂毒肽溶液，得到所述的可控式杀菌的复合水凝胶，记为mlt loaded lnfs@cus/nipam/pam hdrogel。
32.为了考察nipam/am光热水凝胶的结构，本实施例中还制备了未掺杂lnfs@cus的n-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰胺水凝胶，具体制备步骤与步骤(1)基本相同，仅有如下区别：将浓度为1mm lnfs@cus水溶液替换为去离子水，其他条件不变，得到n-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰胺水凝胶，记为nipam/am hydrogel。
33.图1为n-异丙基丙烯酰胺/丙烯酰胺水凝胶(nipam/am hydrogel)的sem图，从图中可以看出合成的水凝胶是具有多孔结构的。
34.图2为光热水凝胶(lnfs@cus/nipam/am hydrogel)的sem图，从图中可以看出，光热剂lnfs@cus的加入并不会影响水凝胶的多孔结构。
35.实施例2：
36.(1)nipam/am光热水凝胶的制备：
37.称量的0.2gn-异丙基丙烯酰胺单体与0.006g的丙烯酰胺单体，以及0.003g的n,n-亚甲基双丙烯酰胺溶于5ml浓度为1mm lnfs@cus水溶液中，超声搅拌，通入氮气去除溶液中的氧气，然后加入50μl浓度为10％过硫酸铵溶液，搅拌均匀后加入15μl的n,n,n,n,四甲基乙二胺，倒入模具(1cm*1cm*cm)中聚合反应10个小时，聚合反应结束后洗涤、干燥，得到nipam/am光热水凝胶，记为lnfs@cus/nipam/am hydrogel。
38.(2)可控式杀菌的复合水凝胶的制备：
39.通过干态浸泡法将0.05g nipam/am光热水凝胶放在10ml浓度为2μm蜂毒肽溶液中48h，待充分溶胀后取出，放入去离子水中浸泡4h，除去表面的蜂毒肽溶液，得到所述的可控式杀菌的复合水凝胶，记为mlt loaded lnfs@cus/nipam/pam hdrogel。
40.实施例3：
41.(1)nipam/am光热水凝胶的制备：
42.称量的0.09gn-异丙基丙烯酰胺单体与0.005g的丙烯酰胺单体，以及0.003g的n,n-亚甲基双丙烯酰胺溶于4ml浓度为1mm lnfs@cus水溶液中，超声搅拌，通入氮气去除溶液中的氧气，然后加入20μl浓度为10％过硫酸铵溶液，搅拌均匀后加入5μl的n,n,n,n,四甲基乙二胺，倒入模具(1cm*1cm*cm)中聚合反应5个小时，聚合反应结束后洗涤、干燥，得到nipam/am光热水凝胶，记为lnfs@cus/nipam/am hydrogel。
43.(2)可控式杀菌的复合水凝胶的制备：
44.通过干态浸泡法将0.04g nipam/am光热水凝胶放在7ml浓度为5μm蜂毒肽溶液中
48h，待充分溶胀后取出，放入去离子水中浸泡4h，除去表面的蜂毒肽溶液，得到所述的可控式杀菌的复合水凝胶，记为mlt loaded lnfs@cus/nipam/pam hdrogel。
45.实施例4：
46.将0.6g实施例3中制备的可控式杀菌的复合水凝胶放入600μl大肠杆菌细菌悬浮液中，在功率为1w，波长为980nm的近红外光照射下，照射10min后，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μl稀释后的悬浮液放到luria bertani固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，去离子水1l,)，在37℃培养18-24h，计算菌落数。
47.图3中大肠杆菌(a)和可控式杀菌的复合水凝胶红外光照射后的大肠杆菌的(b)sem图。从图中可以看出，图3a中大肠杆菌生存良好，图3b中细菌已经发瘪，内部已经凹陷，证明细菌已经全部死亡。这说明了本发明制备的可控式杀菌的复合水凝胶能够有效杀菌。
48.实施例5：
49.本实施例中通过改变蜂毒肽的浓度来考察不同浓度的蜂毒肽对细菌存活率的影响，具体考察步骤如下所示：
50.根据实施例1中所述的方法来制备可控式杀菌的复合水凝胶，仅有以下不同点：步骤(1)中的制备方法完全相同，步骤(2)中蜂毒肽的浓度分别修改为0、2、4、6和8μm，制备得到分别负载了不浓度蜂毒肽的可控式杀菌的复合水凝胶。
51.将上述制备得到的可控式杀菌的复合水凝胶分别取0.6g放入600μl大肠杆菌细菌悬浮液中，在功率为1w，波长为980nm的近红外光照射下，照射10min后，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μl稀释后的悬浮液放到luria bertani固体培养基，在37℃培养18-24h，计算菌落数得出细菌存活率柱状图，如图4所示。所得细菌存活率见表1。
52.表1.不同浓度的蜂毒肽对细菌存活率的影响
53.蜂毒肽浓度(μm)细菌存活率(％)067.42244.85438.79615.880
54.表1为不同浓度的蜂毒肽对细菌存活率的影响，结合表1和图4可以看出随着可控式杀菌的复合水凝胶中蜂毒肽的浓度不断提高，细菌的存活率是逐渐降低的，当蜂毒肽浓度为8.0μm时在功率为1w的条件下照射10min细菌已经全部死亡。
55.实施例6：
56.本实施例中通过改变近红外光辐射功率来考察不同功率的近红外光辐射对细菌存活率的影响，具体考察步骤为：采用实施例1中制备得到的可控式杀菌的复合水凝胶参照实施例4中所述的方法，仅改变近红外光辐射功率为0.5w、1w、1.5w来考察不同功率的近红外光辐射对细菌存活率的影响。图5为可控式杀菌的复合水凝胶在不同功率照射下对细菌存活率的影响，细菌存活率如表2所示。
57.表2.不同功率的近红外光辐射对细菌存活率的影响
58.辐射功率(w)细菌存活率(％)1.50
100.575.360100
59.结合图5和表2可以看出，随着近红外光辐射功率的升高，光热杀菌效率逐渐升高，这是因为较高的辐射功率有利于光热剂产生较高的热，从而使凝胶温度升高药物释放速率加快。在功率为1w的条件下，当光照时间为10min时，细菌存活率已经为0。
60.实施例7：
61.本实施例中通过改变近红外光辐射时间来考察不同时间的近红外光辐射对细菌存活率的影响，具体考察步骤为：采用实施例1中制备得到的可控式杀菌的复合水凝胶参照实施例4中所述的方法，仅改变近红外光辐射时间为10min、8min、6min、4min、2min、0min来考察不同辐射时间的近红外光辐射对细菌存活率的影响。图6为为可控式杀菌的复合水凝胶在不同时间照射下对细菌存活率的影响，细菌存活率如表3所示。
62.表3.不同时间的近红外光辐射对细菌存活率的影响
63.辐照时间(min)细菌存活率(％)100825.49656.65469.95297.040100
64.结合图6和表3可以看出，随着光照时间的不断增加，细菌存活率逐渐减低，这是因为随着近红外光的照射时间不断的延长，凝胶的温度不断升高，达到凝胶的最低临界温度使蜂毒肽被释放出来，从而使细菌存活率降低，当照射是时间为10min时，细菌存活率基本为0。
65.实施例8：
66.本实施例中通过改变细菌种类来考察可控式杀菌的复合水凝胶的杀菌效果，具体考察步骤如下所示：
67.同实例4，仅改变细菌种类，将0.6g实施例1中制备的可控式杀菌的复合水凝胶分别放入600μl金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌悬浮液中，在功率为1w，波长为980nm的近红外光照射下，照射10min后，用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μl稀释后的悬浮液放到luria bertani固体培养基，在37℃培养18-24h，计算菌落数。
68.所见细菌存活率如表4所示
69.表4.细菌种类对可控式杀菌的复合水凝胶的杀菌影响
70.细菌类型细菌存活率(％)金黄色葡萄球菌0大肠杆菌0
71.表4为在功率为1w的近红外光的条件下照射10min后的不同菌种的细菌存活率，从表中可以看出，实施例1中制备的可控式杀菌的复合水凝胶在近红外光照射下，可以杀死多种细菌。并且，其对对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)，革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有强烈
的杀菌效果。
72.综上所述，本发明中制备得到的可控式杀菌的复合水凝胶在近红外光照射下对多种细菌均具有很好的杀菌效果。
73.所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。