一种用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.根据国家癌症中心统计，2015年我国新发癌症病例为186.39/10万，死亡率为105.84/10万，严重威胁人类健康。临床研究将肿瘤归为一种基因病，主要是由于原癌基因的激活或抑制基因的失活所导致。随着高通量测序（ngs）和生物技术的巨大进步，已发现多个与癌症发生发展相关的驱动基因以及可用于指导肿瘤治疗的生物标志物，且针对驱动基因和生物标志物开发了多款药物，在临床治疗中可根据检测到的驱动基因突变或生物标志物进行精准治疗，至此肿瘤的治疗模式从传统治疗转变为精准治疗。
3.现已有的可以用于精准治疗的技术手段包括sanger测序（一代测序）、rt-pcr（荧光定量pcr）、ihc（免疫组织化学法）、fish（荧光原位杂交）等。但上述技术中都存在相应的弊端。例如sanger测序，虽然是测序的金标准，但由于该测序技术一个反应只能得到一条序列，因此测序通量低；虽然单个反应价格低廉，但是获得大量测序的成本高；且检测灵敏度较低，一般只能检测突变丰度在20%以上的突变，所以对于一些低频突变存在漏检的可能。而rt-pcr只能对已知位点进行检测，不能发现未知位点，不利于新靶点的探索。ihc主要用于检测蛋白表达，不能检测基因的点突变（snv）、小片段插入缺失（indel）等，需要根据基因snv/indel指导用药的检测不能通过ihc实现。同理，fish检测虽是鉴定基因融合（fusion）、扩增（cnv）的金标准，但同样不适用snv/indel的检测，应用面存在局限。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题在于克服sanger测序（一代测序）、rt-pcr（荧光定量pcr）、ihc（免疫组织化学法）、fish（荧光原位杂交）技术中检测基因变异的缺陷，从而提供一种用于准确检测肿瘤相关基因变异的试剂盒及其应用。
5.本发明提供一种用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒，包括成套dna探针，所述成套dna探针包括seq id no：1-seq id no：320所示的dna探针。
6.优选的，所述试剂盒还包括杂交反应液。
7.杂交反应液包括xgen
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2x hybridization buffer和xgen
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2x hyb buffer enhancer。
8.成套探针包括seq id no：1-seq id no：320所示的dna探针等摩尔混合。
9.上述的成套dna探针。
10.上述用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒或上述的成套dna探针在如下1)-4）任一种中的应用：1) 检测或辅助检测肿瘤相关基因变异；
2)辅助预测或预测肿瘤患者精准治疗方式；3）辅助诊断肿瘤患者；4）预测受检者肿瘤发病风险。
11.上述的试剂盒或上述的成套dna探针在制备如下1)-4)中任一种产品中的应用：1)检测或辅助检测肿瘤相关基因变异；2)辅助预测或预测肿瘤患者精准治疗方式；3）辅助诊断肿瘤患者；4）预测受检者肿瘤发病风险。
12.所述精准治疗为靶向或免疫治疗等。
13.精准治疗指的是根据肿瘤细胞的分子生物学改变选择相应的药物进行治疗。
14.优选的，所述变异为点突变、小片段插入缺失、拷贝数变异、基因融合和/或微卫星不稳定性。
15.优选的，在上述应用中，所述肿瘤为肾癌、胃癌和/或肠癌。
16.一种检测或辅助检测与肿瘤相关基因变异的方法，包括如下步骤： (1)构建目的基因组dna文库； (2)将前所述的成套dna探针与所述dna文库杂交，得到杂交产物； (3)对所述杂交产物进行二代测序，根据测序结果分析目的基因组dna的变异情况。
17.优选的，在上述方法中，所述肿瘤为肾癌、胃癌和/或肠癌。
18.本发明具有如下优点：1、本发明是可以检测80基因的试剂盒（panel产品），可以精确检测肿瘤相关基因变异，可一次性对目前已经美国食品药品监督管理局（fda）/国家药品监督管理局（nmpa）批准上市的实体瘤靶向药物或免疫检查点抑制剂所对应的生物标志物进行检测。通过采集受检者的肿瘤组织样本及全血样本，进行肿瘤含量评估、dna提取、建库、捕获、测序、生物信息学分析、医学解读，从而找到可用于指导精准治疗的生物标志物。其次，还可以对患者的新辅助治疗进行评估，精准指导患者新辅助治疗方案的选择。最后，还可以对受检者进行遗传性肿瘤的评估，用于提示家族遗传风险，做到早发现、早诊断、早治疗。
19.2、本发明采用高通量测序（ngs）技术的优势包括通量高（一次检测数个基因到数百个基因乃至全外显子组）、灵敏度高、检测限更低、探索能力更强，可发现未知突变、一次检测多种突变类型（snv/indel/fusion/cnv）、还可以检测基因组生物标志物（微卫星不稳定性等）。弥补了现有检测的不足，仅通过一次检测可实现对精准治疗的全面指导。
20.3、本发明检测对象包括目前已上市靶向药物、免疫检查点抑制剂所对应的生物标志物，可充分指导肿瘤的精准治疗。
21.同时本发明可以检测普瑞基准与北肿团队独家发现的胃癌新辅助化疗应答标志物（liz,gaox,pengx,etal.multi-omicscharacterizationofmolecularfeaturesofgastriccancercorrelatedwithresponsetoneoadjuvantchemotherapy[j].scienceadvances,6(9):eaay4211.），可精准指导胃癌新辅助治疗方案的选择。
[0022]
4、本发明还针对肾癌、胃癌、肠癌的遗传性肿瘤相关基因进行优化，充分评估遗传
性肿瘤风险。当受检者存在胚系致病或可能致病遗传易感基因突变，建议家族中尚未发病的健康人进行遗传评估，有助于提前了解相应肿瘤的发病风险。
[0023]
5、本发明包括了与肾癌、胃癌、肠癌发生发展机制相关的基因，实用性要高于全外显子组测序。在临床用药指导以及在后续生物标志物探索方面，都可以提供有价值的信息。
具体实施方式实施例
[0024]
一、用于检测肿瘤相关基因变异的试剂盒用于检测肿瘤相关基因变异的试剂盒，包括seqidno：1-seqidno：320所示的320条dna探针。
[0025]
探针的获得过程为：为了实现对肾癌、胃癌、肠癌的精准治疗，本发明采用目标区域捕获二代测序技术，经过分析、选择得到与肿瘤个体化用药及遗传风险相关的80个（见表1）基因的全部外显子区域、部分基因的热点区域，以及化疗药物相关snp位点。从而检测与肾癌、胃癌、肠癌有明确临床意义的基因点突变（snv）、小片段插入缺失（indel）、拷贝数变异（cnv）、基因融合（fusion）以及微卫星不稳定性（msi）等生物标志物，进一步指导肿瘤的精准治疗。同时也可以根据肿瘤患者检测到的基因突变辅助入组相应的临床试验。对临床治疗、诊断以及新靶点的发现提供指导意义。
[0026]
根据上述与肿瘤个体化用药及遗传风险相关基因的全部外显子区域、部分基因的热点区域，以及化疗药物相关snp位点，设计探针。探针的设计方法如下：利用idt公司的在线探针设计工具(https://sg.idtdna.com/sessiontimeout.aspx)，参数为1xtilling和120个核苷酸长度。对idt完成设计的探针进行探针覆盖度的评估，对低覆盖度的区域使用多xtilling的策略重新设计探针，力争使所有的目标区域都有探针覆盖。
[0027]
表180个基因列表
akt1akt2akt3alkapcararafarid1ab2mbmpr1abrafbrca1brca2c10orf71ccne1cdh1cdk4cdk6cdkn2actnnb1egfrepcamerbb2esr1esr2fgf19fgfr1fgfr2fgfr3fgfr4fhflcnflt1flt4hoxb13hrasidh1idh2jak1jak2kdrkitkrasmap2k1mdm2mdm4metmlh1msh2msh6mtormutyhmycnf1nf2nrasntrk1ntrk2ntrk3pbrm1pdgfrapgrpik3capms2pold1poleptenrb1retrhoaros1sdhbsdhcsdhdsmad4stk11tp53tsc1tsc2vhl
二、利用试剂盒检测肿瘤相关基因变异步骤1：提取检测样本dna（样本dna为血液样本dna或肿瘤组织样本dna）。
[0028]
步骤2：检测样本dna文库的构建。主要步骤有：dna打断、末端修复、接头连接、文库扩增、纯化。
[0029]
（一）dna文库的构建包括如下步骤1、样本制备
对于石蜡包埋组织样本，使用 qiagen 公司 qiaamp dna ffpe tissue kit，血液样本使用qiaamp dna blood mini kit，严格按照说明书步骤进行。所提 dna 需要进行定量检测，提取后的 dna 使用 qubit
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dsdna hs assay kit 及配套仪器进行检测，提取总量应不少于 50ng。
[0030]
2、dna文库构建使用商品化文库构建试剂盒idt xgen prism dna library prep kit（idt，cat no.10006203）按照如下流程进行文库构建。
[0031]
2.1 取样打断1）打断体系如表2所示。
[0032]
表2打断方式打断体系（μl）dna投入量（μl）补te体积（μl）covaris打断50x50-xbioruptor打断60x60-xqiaamp dna ffpe tissue kit 提取的dna（简称ffpe dna）使用covaris打断，血液基因组dna使用covaris打断或bioruptor打断。
[0033]
2）covaris打断操作的打断参数如表3所示。
[0034] 3）bioruptor打断操作如下：a． 打断仪打断参数如表4所示。
[0035] b．打断后的dna用2%琼脂糖凝胶电泳质检，使用50bp和d2000 ladder，电压150v，电泳条带在200bp-300bp为合格。
[0036]
2.2 末端修复1)按照表5，配制end repair mix。
[0037]
2）参照表6，设置end repair反应程序，调节热盖温度为40℃。
[0038]
3）将样本放入pcr仪，运行end repair反应程序。
[0039]
4）将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
[0040]
2.3 配制ligation 1 mix按照表7，配制ligation 1 mix。
[0041]
2.4 末端修复后纯化1)从4℃冰箱取出ampure xp磁珠，室温平衡30min。
[0042]
2)取147.5μl（2.5
×
）ampure xp磁珠加入到末端修复样品中，充分混匀。
[0043]
3)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
[0044]
4) 沿管侧壁缓慢加入160μl 80%（v/v）乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
[0045]
5) 重复步骤4)一次。
[0046]
6) 用10μl移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
[0047]
7) 向样品管中加入30μl ligation 1 mix，震荡混匀，瞬时离心。
[0048]
2.5 ligation 11）参照表8，设置ligation 1反应程序，调节pcr仪热盖温度为70℃。
[0049]
2）运行ligation1反应程序。
[0050]
2.6ligation21）按照表9，配制ligation2mix。
[0051]
2）从pcr仪上取出ligation1的pcr反应管，瞬时离心后置于冰上。向每个反应管中分装10μlligation2mix，振荡混匀，瞬时离心。
[0052]
3）参照表10，设置ligation2反应程序，调节pcr仪热盖温度为70℃。
[0053]
4）将样本放入pcr仪，运行ligation2反应程序。
[0054]
2.7adaptor连接后纯化1)取100μl（2.5
×
）peg/nacl加入到ligation2反应后的样品中，充分混匀。
[0055]
2)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
[0056]
3)沿管侧壁缓慢加入160μl80%（v/v）乙醇，静置30s,使用移液器移弃上清。
[0057]
4)重复步骤3）一次。
[0058]
5)用10μl移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
[0059]
6)向样品管中加入20μl无核酸酶水，震荡混匀，瞬时离心。
[0060]
2.8 pcr扩增1)按照以下表11体系在pcr管中配制pcr反应体系。
[0061]
2）振荡混匀，瞬时离心使全部反应液置于pcr管底部。
[0062]
pcr扩增程序如表12。
[0063]
2.9 文库纯化与定量1) 从4℃冰箱取出ampure xp磁珠，室温平衡30min。
[0064]
2) 将pcr产物从pcr仪中拿出，瞬时离心，放在磁力架上静置5min，将上清液转移至新管中。
[0065]
3)取65μl（1.3
×
）ampure xp磁珠加入到pcr产物中，用移液器（量程65μl）吹打20下，充分混匀。
[0066]
4) 室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
[0067]
5)沿管侧壁缓慢加入160μl 80%（v/v）乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
[0068]
注：若弃废液时吸到磁珠，需静置2min，待磁珠被吸附后，弃上清。
[0069]
6) 重复步骤5）一次。
[0070]
7) 用10μl移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
[0071]
8) 向样品管中加入32μl te buffer ph 8.0，震荡混匀，瞬时离心，室温孵育
8min。
[0072]
9) 将样品管置于磁力架上5min，至液体完全澄清，使用移液器小心将30μl上清转移至新的1.5ml离心管中。
[0073]
10）使用qubit 4.0荧光定量仪对文库qubit进行定量。
[0074]
2.10 文库质检结果如表13所示。
[0075]
2.11 文库保存，将文库放入扩增区-20℃冰箱存放。
[0076]
步骤3：将探针（seq id no：1-seq id no：320），与dna文库杂交捕获、洗脱、纯化并测序。探针由生物公司合成。
[0077]
文库杂交步骤如下：1、将 human cot dna和 xgen
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universal blockers-ts mix振荡混匀，瞬时离心。
[0078]
2、按照表14，配制杂交反应液mix。
[0079]
表14humancotdna5μlxgen
®
universalblockers-tsmix2μltotal7μl3、向离心管中加入7μl mix以及500ng-1ug dna文库，震荡混匀，瞬时离心。并放入真空浓缩仪中干燥，备用。
[0080]
4、按照表15，将xgen
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2x hybridization buffer 和xgen
®ꢀ
2x hyb buffer enhancer振荡混匀，瞬时离心，得到杂交反应液。
[0081]
表15xgen
®
2xhybridizationbuffer8.5μlxgen
®
2xhybbufferenhancer2.7μltotal11.2μl 5、向蒸干后的样本中加入上述杂交反应液、4μl探针，于恒温混匀仪上25℃孵育10min。
[0082]
6、放入pcr仪中，点击程序，开始运行。pcr程序如表16：
文库洗脱步骤如下：1、链霉亲和素磁珠清洗1）将xgen
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2x hybridization buffer和xgen
®ꢀ
2x hyb buffer enhancer振荡混匀，瞬时离心。
[0083]
2）按照表17，配制磁珠悬浮液mix表17xgen
®
2xhybridizationbuffer8.5μlxgen
®
2xhybbufferenhancer2.7μlnuclease-freewater5.8μltotal17μl3）将dynabeads m-270 streptavidin 振荡混匀。每个文库dynabeads m-270 streptavidin 的用量为50μl。
[0084]
4）每个文库 1xbead wash buffer（nuclease-free water和xgen
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2x bead wash buffer按1:1比例配制）的用量为100μl，向管中加入相应体积的1x bead wash buffer振荡混匀（n
×
100 μl），瞬时离心，置于磁力架1min，待液体完全澄清，使用移液器吸弃上清。
[0085]
5）重复步骤4）两次。
[0086]
6）用移液器将残留液体吸出。
[0087]
7）每个文库磁珠悬浮液的用量为17μl，向管中加入相应体积的磁珠悬浮液悬浮。
[0088]
8）准备相应个数的pcr管，每个管中分装17μl的磁珠与悬浮液的混合液。
[0089]
9）将含有磁珠悬浮液的pcr管放入pcr仪中孵育5min。
[0090] 2、链霉亲和素磁珠捕获1）4-16h杂交反应后，将重悬的链霉亲和素磁珠混匀后分两次加到杂交体系中。将样本管转移至正在运行pcr仪中，并点击下一步。
[0091]
2）65℃孵育45min，每15min振荡混匀一次，确保磁珠完全重悬。
[0092]
3、热洗脱1）打开pcr仪设置程序如表18。
[0093]
2）将分装好的装有1x wash bufferⅰ（ nuclease-free water和xgen
®ꢀ
10x wash bufferⅰ按1:9比例配制）和1x stringent wash buffer（nuclease-free water和xgen
®ꢀ
10x stringent wash buffer按1:9比例配制）的pcr管放在pcr仪中预热。
[0094]
3）45min 65℃孵育结束后，将与链霉亲和素磁珠捕获后的杂交样本转移至装有1x wash bufferⅰ的pcr管中混匀。将pcr管置于磁力架上1min，待液体完全澄清后，用移液器彻底移弃上清。
[0095]
4）将1x stringent wash buffer转移至装有样本磁珠的pcr管中，混匀，盖紧管盖，放入pcr仪中65℃孵育5min。到时间后将装有样本的pcr管置于磁力架上至澄清，用移液器彻底移弃上清。
[0096]
5）重复步骤4）一次。
[0097]
4、常温洗脱1）将装有样本的pcr管从磁力架取下，用移液器从分装管中吸取150ul 1x wash bufferⅱ（nuclease-free water和xgen
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10x wash bufferⅱ按1:9比例配制）加入装有磁珠的pcr管中，室温孵育2min，期间于恒温混匀仪上混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。将pcr管瞬时离心后于磁力架静置1min，用移液器彻底移弃上清。
[0098]
2）将装有样本的pcr管从磁力架取下，瞬时离心后上磁力架，用移液器移去少量残余buffer。
[0099]
3）向管中加入21μl nuclease-free water，吹吸混匀。
[0100]
4）提前15-20min将kapa hifi hotstart readymix、引物fcf（10μm）和fcr（10μm）置于4℃融解。
[0101]
5）按照表19，在pcr管或离心管进行反应体系配制。
[0102]
6）将配置好的mix分装到标记样本序号的pcr管中。
[0103]
7）用移液器转移20μl带磁珠产物至对应关系的pcr管中，混匀。
[0104]
8）在pcr仪上启动如表20程序。
[0105]
文库纯化步骤如下：1）将ampure xp磁珠振荡混匀，吸取60μl加入至做好标记的pcr管中。
[0106]
2）pcr扩增后，取出pcr管并置于磁力架2min，待液体完全澄清后，将上清转移至磁力架的pcr管中。
[0107]
3）振荡混匀，室温孵育10min。
[0108]
4）将pcr管瞬时离心后置于磁力架上5min，待液体完全澄清后，移弃上清（留5-10μl液体）。
[0109]
5）沿pcr管侧壁缓慢加入200μl 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
[0110]
6）重复步骤5）一次。
[0111]
7）将pcr管从磁力架取出，瞬时离心后置于磁力架上，使用移液器移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
[0112]
8）打开pcr管盖，使磁珠置于室温干燥，磁珠表面无液体反光，注意不能过度干燥。
[0113]
9）向pcr管加入31μl te buffer ph 8.0，振荡混匀，室温孵育5min。
[0114]
10）将pcr管瞬时离心后置于磁力架上1-2min，至液体完全澄清，用移液器小心将30μl上清转移至新的1.5ml离心管中，注意勿吸到磁珠。
[0115]
11）进行文库质检，合格后上机测序。
[0116]
步骤4：对测序结果进行生物信息学分析，获得检测样本的突变结果。
[0117]
使用fastp（v0.19.4）软件去除实验及测序环节引入的接头序列及低质量碱基序列获得高质量测序数据。其中，要求数据质量满足q30≥80%，否则判定为质控不通过。
[0118]
使用bwa（0.7.17）序列比对软件将上述满足要求的数据比对至hg19（grch37）参考基因组上，生成记录比对结果的bam格式文件。然后使用samtools（v1.9）和genomeanalysistk（v4.1.0）工具对bam文件进行排序、去重及碱基质量校正，获得最终bam文件，并基于此文件进行后续突变分析。
[0119]
其中，参考基因组比对率需≥90%，对照样本目标区域平均测序深度需≥100
×
，肿瘤样本目标区域平均测序深度需≥500
×
，目标区域内深度大于平均深度
×
0.2的位点比例需≥90%，肿瘤和对照样本配对一致性需≥90%。以上任一条件不满足均判定质控不通过，需要重新实验。
[0120]
使用genomeanalysistk（v4.1.0）的变异鉴定模块对样本中的点突变、插入缺失突变进行分析；使用融合分析模块对样本中的基因融合事件进行分析；使用拷贝数变异分析模块（包含cnvkit（v0.9.6）软件和过滤模块）对样本中的拷贝数变异进行分析。得到最终能够进入注释流程的突变。
[0121]
对得到的突变采用如下方法进行注释：使用基于annovar（v2018.04.16）搭建的变异注释模块对点突变、小片段插入缺失、基因融合及拷贝数变异进行注释，注释使用的数据库包括clinvar、cosmic、1000genomes等。
[0122]
另外，使用微卫星不稳定性分析模块对样本的微卫星不稳定性（msi）进行分析。
[0123]
步骤5：对突变结果进行注释，判断突变的致病性，为临床提供相应信息。
[0124]
基于步骤4中对变异的注释结果，针对检出的非良性/可能良性变异，根据《acmg遗传变异分类标准与指南》规定的变异分类标准以及美国病理协会（amp）/美国临床肿瘤学会（acso）/美国病理学家协会（cap）联合发布的癌症变异解读指南（standards and guidelines for the interpretation and reporting of sequence variants in cancer）对变异进行分类。
[0125]
以肾癌患者为例进行以下说明：按照上述步骤对某肾癌患者进行检测，结果为：微卫星不稳定性高（msi-h），根据美国食品药品监督管理局（fda）批准，微卫星不稳定性高实体瘤（包括肾癌）患者可以从可瑞达（帕博丽珠单抗）中获益。
[0126]
按照上述步骤对某胃癌患者进行检测，结果为：微卫星不稳定性高（msi-h）。根据美国食品药品监督管理局（fda）批准，微卫星不稳定性高的实体瘤（包括胃癌）患者可以从可瑞达（帕博丽珠单抗）中获益。
[0127]
按照上述步骤对某结直肠癌患者进行检测，结果为：检测到kras c.35g》a p.g12d体细胞错义变异，变异丰度为24.91%。根据结直肠癌美国国立癌症综合网络（nccn）指南以及中国临床肿瘤学会（csco）结直肠癌诊疗指南，存在该变异的患者不能使用西妥昔单抗和帕尼单抗进行治疗。患者可考虑其余方式进行治疗，例如常规化疗。
[0128]
三、对上述试剂盒性能进行了充分验证，具体验证情况如下：1、建库起始量评估评估不同起始量对检测结果的影响。选取3例样本，分别使用30ng、50ng和100ng dna起始建库，每个样本做三次重复。对比起始量对检测结果的影响。从而评估不同起始量下样本质控是否通过及目标变异是否检测出。结果显示30ng条件下样本质控通过且目标变异全部检出，因此最低投入量为30ng。
[0129]
2、阳性符合率检测22例样本，变异类型包含单核苷酸变异（snv）、小片段插入缺失（indel）和拷贝数变异（cnv）。所有变异均用数字pcr或一代测序、qpcr等方法验证。结果显示所有目标变异全部检出，即阳性位点符合率为100%。
[0130]
3、阴性符合率检测20例阴性样本，评估有无目标阳性变异检出。结果显示目标变异均为检出，即阴性符合率为100%。
[0131]
4、最低检测限
选择3例样本，变异类型包括单核苷酸变异（snv）、小片段插入缺失（indel）、拷贝数变异（cnv）和融合（fusion），样本来源为标准品和临床样本。每一个突变频率各做3次平行。变异频率设置：snv和indel设置的期望频率为1%、2%、5%，cnv设置的期望拷贝数为2.5拷贝数、3拷贝数、3.5拷贝数，fusion设置期望频率为1%、2%、5%。最终以变异位点全部检出的最低期望频率作为最低检测限。
[0132]
最终结果显示：1）snv变异位点频率在2%以上的位点全部检出，因此snv的最低检测限为2%。
[0133]
2）indel变异位点频率在5%以上的位点全部检出，因此indel的最低检测限为5%。
[0134]
3）cnv变异拷贝数在3以上的全部检出，因此cnv最低检测限为3。
[0135]
4）fusion变异位点频率在5%以上的位点全部检出，因此fusion的最低检测限为5%。
[0136]
5、重复性选择6例临床样本，进行3次批内重复及3次批间重复检测。结果显示同一样本批次内及批次间重复性检测结果一致。
[0137]
6、干扰物分析选取6例样本，分别添加干扰物质胆红素（浓度342μm）、甘油三酯（浓度37mm）、血红蛋白（浓度2g/l）及80%（v/v）乙醇，每例样本每个处理做3个重复。结果显示：胆红素（浓度342μm）、甘油三酯（浓度342mm）、血红蛋白（浓度2g/l）、80%乙醇均对检测结果无影响。
[0138]
7、dna质量评估选19例不同质量等级的样本，使用100ng dna建库。从而评估不同质量的样本对变异检出的影响。dna主条带＞500bp的样本，变异位点均可被检出。
[0139]
8、肿瘤细胞占比评估经验证的组织样本，肿瘤含量均在20%-90%之间，所有阳性位点均被检出。即本试剂盒（panel）可对肿瘤含量≥20%的样本进行检测。
[0140]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒，其特征在于，包括成套dna探针，所述成套dna探针包括seq id no：1-seq id no：320所示的dna探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交反应液。3.权利要求1或2中所述的成套dna探针。4.权利要求1或2中所述的用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒或权利要求3所述的成套dna探针在如下1)-3）任一种中的应用：1) 检测或辅助检测肿瘤相关基因变异；2) 辅助预测或预测肿瘤患者精准治疗方式；3）预测受检者肿瘤发病风险。5.权利要求1或2所述的用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒或权利要求3所述的成套dna探针在制备如下1)-4)中任一种产品中的应用：1) 检测或辅助检测肿瘤相关基因变异；2) 辅助预测或预测肿瘤患者精准治疗方式；3）辅助诊断肿瘤患者；4）预测受检者肿瘤发病风险。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述变异为点突变、小片段插入缺失、拷贝数变异、基因融合和/或微卫星不稳定性。7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肾癌、胃癌和/或肠癌。8.一种检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的方法，包括如下步骤： (1)构建目的基因组dna文库； (2)将权利要求3中所述的成套dna探针与所述dna文库杂交，得到杂交产物；(3)对所述杂交产物进行二代测序，根据测序结果分析目的基因组dna的变异情况。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述肿瘤为肾癌、胃癌和/或肠癌。

技术总结
一种用于检测或辅助检测肿瘤相关基因变异的试剂盒及其应用，包括成套DNA探针，所述成套DNA探针包括SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：320所示的DNA探针。本发明是可以检测80基因的试剂盒（Panel产品），可一次性对目前已经美国食品药品监督管理局（FDA）/国家药品监督管理局（NMPA）批准上市的实体瘤靶向药物或免疫检查点抑制剂所对应的生物标志物进行检测。通过采集受检者的肿瘤组织样本及全血样本，进行肿瘤含量评估、DNA提取、建库、捕获、测序、生物信息学分析、医学解读，从而找到可用于指导精准治疗的生物标志物。疗的生物标志物。


技术研发人员：季序我 邓晨旭 韦宝耶 董宇
受保护的技术使用者：普瑞基准生物医药（苏州）有限公司 北京普康瑞仁医学检验所有限公司
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25