一种唾液和鼻腔双样本一体化加样的检测技术及其应用的制作方法

1.本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种唾液和鼻腔双样本同时采样并进行一体化加样检测的检测技术及其应用。


背景技术：

2.免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫层析测定技术、化学发光检测技术、免疫荧光标记技术、量子点免疫检测技术、胶体金免疫检测技术、乳胶微球免疫检测技术、斑点免疫检测技术等。高灵敏度、快速、便捷、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋势，正在通过多种技术创新和技术改进进行完善。床旁检测（poct）是目前发展最快的一个分支，层析免疫检测是其最常用的检测方法，胶体金、荧光侧向流层析免疫检测和乳胶微球免疫检测技术产品使用最广，但所采用的方法一般均为单一样本的采样检测。众所周知，鼻拭子或前鼻拭子检测是目前多数呼吸道传染性疾病的重要采样方式，呼吸系统的病毒载量高，但缺陷是采集和使用的可接受性和便捷性，检测过程均需要提取液对样本进行前处理。唾液也是作为检测样本之一，但其病毒载量相较鼻拭子而言比较低，影响病例的阳性检出率。因此，开发唾液和鼻腔双样本采样并检测的技术，不仅可以做到两种采集样本中病毒载量的叠加，同时通过对检测系统的优化处理，将唾液做成了一种有效的溶剂使用，进而实现了不需要提取液的快速检测，实现了检测试剂使用的更加优越的准确性、便捷性、快速性和操作简单性，将有助于临床检测产品的普及使用，提高诊疗防治质量，具有重要的应用价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种唾液和鼻腔双样本同时采样并加样检测的一体化检测技术及其应用，与现有技术比较，具有检测灵敏度高、便捷、快速、防止污染等的特点，提高检测质量。
4.针对上述目的，本发明提供的一种唾液和鼻腔双样本一体化加样的检测技术，包括如下步骤：采用唾液采样结构将唾液样本采集至唾液采集容器内，采用鼻腔采样结构将采样头伸入鼻腔内采集鼻腔样本，直接将采集有鼻腔样本的所述采样头置入至采集的唾液样本内，搅拌洗脱，形成唾液样本与鼻腔样本的混合液相，并使所述混合液相浸泡吸收到所述鼻腔采样结构的采样头上，然后将所述采样头直接插入设置于层析检测结构上的检测样本采集结构内，所述混合液相被直接加载至与所述检测样本采集结构具有液流交通的检测试纸条的样本垫上，流经标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫，通过观察所述固相层析检测膜上标记物被间接捕获的量，读取检测结果，完成检测过程。
5.上述所述检测技术中，所述唾液采样结构为设有开口的容器结构。
6.上述所述检测技术中，所述鼻腔采样结构为前端设置有由吸水材料制备的采样头
的棒状结构。
7.上述所述检测技术中，所述层析检测结构为一种壳状结构，前端设置有采样头插入口，上方设置有观察窗，内部设置有所述检测样本采集结构、检测试剂条放置托槽和位于所述托槽上的所述检测试剂条以及所述检测样本采集结构与检测试剂条之间的液流交通开口，其中所述检测试剂条从所述采样头插入口向远端依次排列所述样本垫、标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫。
8.上述所述检测技术中，所述唾液采样结构由漏斗状的上大下小的唾液采集结构和试管状的唾液收集容器结构组成，两者间为可拆装式分体状结构。
9.上述所述检测技术中，所述鼻腔采样结构为所述采样头与所述采样手柄直接连接并伸出至所述采样手柄外部的插入式结构。
10.上述所述检测技术中，所述固相层析检测膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、deae纤维素膜的至少一种。
11.上述所述检测技术中，所述标记物结合垫中的标记物选择胶体金属、荧光标记物、乳胶微球的至少一种。
12.本发明所述检测技术在免疫检测产品的研究开发中的应用。
13.所述采样头为由吸水性且不溶于水的材料制成，包括天然及改性高分子高吸水性树脂和人工合成吸水性树脂，有淀粉系列、纤维素系列、其他天然产物系列、聚乙烯酸盐系列、聚乙烯醇系列和聚氧乙烯系列等，其中部分聚乙烯醇系列产品拥有干燥变硬、吸水变软的特性，如植绒、海绵、聚酯纤维、涤纶、棉花、多种人造纤维等。
14.所述检测技术包含有助检液相，所述助检溶液为非变性剂的水质缓冲盐溶液。
15.所述检测试剂条为在pvc底片上依次粘贴的样本垫、标记物结合垫、过滤膜垫、硝酸纤维素膜垫和吸水纸垫的结构，放置于检测卡内。
16.本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明为采用唾液和鼻腔双样本采样和检测的检测技术，检测时同时采集唾液和鼻腔的双重样本，这样可以显著提高病例的阳性检出率，提高疾病的检测灵敏度，而并不像现有市场只能提高检测试剂本身的灵敏度而无法改变待检样本的病原体载量。众所周知，鼻拭子或前鼻拭子检测是目前多数呼吸道传染性疾病的重要采样方式，呼吸系统的病毒载量高，但缺陷是采集和使用的可接受性和便捷性，检测过程均需要提取液对样本进行前处理。唾液也是作为检测样本之一，但其病毒载量相较鼻拭子而言比较低，影响病例的阳性检出率。本发明采用唾液和鼻腔双样本采样，不仅可以做到两种采集样本中病毒载量的叠加，同时通过对检测系统的优化处理，将唾液做成了一种有效的溶剂使用，进而实现了不需要提取液的快速检测，实现了检测试剂使用的更加优越的准确性、便捷性、快速性和操作简单性。
17.2、本发明鼻腔采样结构既是作为鼻腔待检物的采集结构，同时又是对唾液和鼻腔待检物进行检测时加样的结构，唾液采样结构既是唾液待检物的采集结构，同时唾液采集物又是鼻腔待检物的溶媒液相以及对待检物进行检测的流动液相，对采样结构进行了创造性的多功能设计。
18.3、本发明唾液采样结构为带有收集管的漏斗状结构，使唾液进漏斗吐入后直接进入收集管，操作解便，避免污染。
19.4、本发明所采样的采样结构包括采样手柄和采样头，其中采样头具有采样和检测上样的双重功能，实现了采集便捷、样本转移和上样安全等多种优势。
20.5、本发明将含有唾液采集物和鼻腔采集物的混合物的采样头直接插入设置于层析检测结构的检测样本采集结构内，被浸泡吸收的所述混合液相直接加载至与所述检测样本采集结构具有液流交通的检测试纸条的样本垫上，启动检测反应，不仅保证了取样的准确性，而且保证了在取样过程中不影响检测试剂条结构及检测功能。
21.6、本发明采用检测试条作为检测部件，适用于多种以侧向流为主要技术特征的检测技术，如胶体金、荧光免疫、乳胶微球免疫检测等，拓展了其应用范围。
22.7、本发明配备了助检液相，可用于液相不充分的样本，提高了检测的实用性。
23.8、本发明操作步骤简单，易于实现家庭化使用或自我检测，不仅使用方便、减少原料的浪费，同时也显著提高工作效率，应用于专业和业余检测的诸多领域。
附图说明
24.图1为本发明的技术流程示意图；图2为本发明的鼻腔采样结构示意图；图3为本发明的唾液采样结构示意图；图4为本发明的层析检测结构示意图；图5为本发明的检测样本采集结构示意图；图6为鼻拭子采样抗原检测与pcr核酸检测的临床比对研究；图7为唾液采样抗原检测与pcr核酸检测的临床比对研究；图8为本发明双样本采样抗原检测与pcr核酸检测的临床比对研究。
25.图中标记如下：鼻腔采样手柄1；鼻腔采样固定结构2；鼻腔采样头3；唾液采集结构4；唾液收集结构5；检测连接结构6；层析检测结构7；观察窗8；检测外壳上盖9；检测外壳底座10，检测连接采样头插入口11；检测样本采集结构12；检测试剂条13。
具体实施方式
26.为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下所述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下说明。
27.如图1所示，本发明的技术流程，包括唾液采样结构、鼻腔采样结构和层析检测结构3个模块，操作步骤包括：采用唾液采样结构将唾液样本采集至唾液采集容器内，采用鼻腔采样结构将采样头伸入鼻腔内采集鼻腔样本，直接将采集有鼻腔样本的所述采样头置入至采集的唾液样本内，搅拌洗脱，形成唾液样本与鼻腔样本的混合液相，并使混合液相浸泡吸收到所述鼻腔采样结构的采样头上，然后将所述采样头直接插入设置于层析检测结构的检测样本采集结构内，被浸泡吸收的所述混合液相直接加载至与所述检测样本采集结构具有液流交通的检测试纸条的样本垫上，流经标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫，通过观察所述固相层析检测膜上标记物被间接捕获的情况，读取检测结果，完成检测过程。
28.如图2所示，本发明鼻腔采样结构，包括采样手柄1、采样头固定结构2、采样头3、其中采样头3经采样头固定结构2固定于采样手柄1上，操作时手持采样手柄1，将采样头3置于
前鼻腔进行采样。
29.如图3所示，本发明唾液采样结构可选用漏斗状的唾液采集结构4，向下与唾液收集管5形成可拆装式连接，使用时唾液经口腔吐至唾液采集结构4，流入唾液收集管5内，然后将完成采样后的载有鼻腔样本的采样头3插入至唾液收集管5内，贴壁搅动唾液，形成鼻腔样本与唾液样本的混合物并浸泡吸收至采样头3上，完成双样本一体化的采样过程。
30.如图4、图5所示，本发明的层析检测结构，有用于检测加样的鼻腔采样结构，包括采样手柄1、固定结构2和采样头3，以及用于样本检测的层析检测结构，包括检测连接结构6、层析检测结构7、观察窗8、检测外壳上盖9、检测外壳底座10、检测连接采样头插入口11、检测样本采集结构12和检测试剂条13。
31.这样在实际操作时，当本发明检测技术为胶体金免疫检测结构时，检测试剂条13为用胶体金法制备的试纸条，在pvc支撑板上依次粘贴有样品垫、包被有胶体金标记物的胶体金结合垫、包被有非标记捕获试剂的硝酸纤维素膜垫和吸水纸垫；当本发明检测技术为荧光免疫检测结构时，检测试剂条13为用荧光免疫法制备的试纸条，在pvc支撑板上依次粘贴有样品垫、包被有荧光标记物的荧光微球结合垫、包被有非标记捕获试剂的硝酸纤维素膜垫和吸水纸垫；当本发明检测技术为乳胶微球免疫检测结构时，检测试剂条13为用乳胶微球免疫法制备的试纸条，在pvc支撑板上依次粘贴有样品垫、包被有乳胶微球标记物的乳胶微球结合垫、包被有非标记捕获试剂的硝酸纤维素膜垫和吸水纸垫。使用时，取出唾液采样结构、鼻腔采样结构和层析检测结构，采用唾液采样结构将唾液样本经唾液采集结构4，采集入唾液收集管5内；手持采样手柄1，将采样头3伸入鼻腔内采集鼻腔样本，直接将采集有鼻腔样本的采样头3置入至采集的唾液样本内，搅拌洗脱，形成唾液样本与鼻腔样本的混合液相，并使混合液相浸泡吸收到采样头3上，然后将采样头3经检测连接采样头插入口11直接插入设置于层析检测结构的检测样本采集结构12内，被浸泡吸收的混合液相直接被加载至与检测样本采集结构12具有液流交通的检测试纸条13的样本垫上，流经标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫，通过观察所述固相层析检测膜上标记物被间接捕获的情况，读取检测结果，完成检测过程。
32.本发明的实验研究：下述实验说明本发明的检测技术及其效果，但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实验一：本发明免疫胶体金法新冠病毒抗原快速检测实验：一、检测试剂条制备：采用常规免疫胶体金检测技术双抗体夹心法制备检测试剂条，采用本发明检测技术制备检测试剂条进行新冠病毒抗原检测实验，其中检测试剂条的检测线t的胶体金标记指示抗体为10ug/ml的抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体，采用粒径50nm的胶体金颗粒，包被在玻璃纤维素膜胶体金结合垫上；检测试剂条的检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的配对的抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜上；检测试剂条的质控线c的捕获抗体为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜上，用于捕获未被特异性捕获的胶体金标记抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体。在硝酸纤维素膜印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金标记结合膜垫，在结合膜垫一侧粘贴样本垫。置粘贴好的检测片于切条机上，切成 3.5mm试纸条。
34.二、本发明层析检测结构制备：采用solidworks设计本发明层析检测结构的上盖、底座、鼻腔采样结构和唾液采样结构并用3d打印样品，在采样头固定结构上粘贴海绵采样头，采用小型实验用保存管作为唾液采样收集管，制备层析检测结构样品用于实验检测。
35.三、实验方法及结果：实验时取上述制备的检测试剂条和层析检测结构，装配成检测扣卡，将装配的检测扣卡放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。配制两种待检溶液，1）用健康人唾液（唾液）配置不同浓度的重组新冠病毒抗原n蛋白溶液；2）用非灭活型病毒保存液（utm）配置3倍于溶液1）浓度的不同浓度的重组新冠病毒抗原n蛋白溶液。分别采用两种方法进行检测，方法一：取150ul溶液1），加入试管内，取鼻腔采样结构，采集健康人鼻腔样本，将采样头插入至溶液1）内，搅动吸收溶液1），然后经插入口插入检测扣卡内，静置20分钟，观察检测窗，读取试纸条上的显色结果。方法二：取100ul不加n蛋白的健康人唾液，加入试管内，取鼻腔采样结构，采集健康人鼻腔样本，再取50ul溶液2）加至鼻腔采样后的采样头上，将采样头插入至空白健康人唾液内，搅动吸收空白健康人唾液溶液，然后经插入口插入检测扣卡内，静置20分钟，观察检测窗，读取试纸条上的显色结果。检测试纸条质控线c有显色，检测线t 无显色，为阴性；质控线c有显色，检测线t 也有显色，为阳性。结果在抗原n蛋白溶液终浓度1.0、0.1、0.05、0.01ng/ml两种方法均为阳性反应，0.001ng/ml及以下则均为阴性反应。
36.实验二：本发明乳胶微球免疫层析法新冠病毒抗原快速检测实验：一、检测试剂条制备：采用常规乳胶微球免疫层析技术双抗体夹心法制备检测试剂条，采用本发明层析检测结构制备检测试剂盒进行新冠病毒抗原检测实验，其中乳胶微球均采用度生物300nm红色微球，检测试剂条的检测线t的乳胶微球标记指示抗体为50ug/ml的抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体，包被在玻璃纤维素膜结合垫上；检测试剂条的检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的配对的抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜上；检测试剂条的质控线c的捕获抗体为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜上，用于捕获未被特异性捕获的乳胶微球标记抗新冠病毒n蛋白单克隆抗体。在硝酸纤维素膜印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及乳胶微球标记结合膜垫，在结合膜垫一侧粘贴样本垫。置粘贴好的检测片于切条机上，切成 3.5mm试纸条。
37.二、本发明层析检测结构制备：同“实验一”制备。
38.三、实验方法及结果：实验时取上述制备的检测试剂条和层析检测结构，装配成检测扣卡，将装配的检测扣卡放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。同上，配制两种待检溶液，1）用健康人唾液（唾液）配置不同浓度的重组新冠病毒抗原n蛋白溶液；2）用非灭活型病毒保存液（utm）配置3倍于溶液1）浓度的不同浓度的重组新冠病毒抗原n蛋白溶液。分别采用两种方法进行检测，方法一：取150ul溶液1），加入试管内，取鼻腔采样结构，采集健康人鼻腔样本，将采样头插入至溶液1）内，搅动吸收溶液1），然后经插入口插入检测扣卡内，静置20分钟，观察检测窗，读取试纸条上的显色结果。方法二：取100ul不加n蛋白的健康人唾
液，加入试管内，取鼻腔采样结构，采集健康人鼻腔样本，再取50ul溶液2）加至鼻腔采样后的采样头上，将采样头插入至空白健康人唾液内，搅动吸收空白健康人唾液溶液，然后经插入口插入检测扣卡内，静置20分钟，观察检测窗，读取试纸条上的显色结果。检测试纸条质控线c有显色，检测线t 无显色，为阴性；质控线c有显色，检测线t 也有显色，为阳性。结果在抗原n蛋白溶液浓度1.0、0.1、0.05、0.01ng/ml两种方法均为阳性反应，0.001ng/ml及以下则均为阴性反应。
39.实验三：本发明单样本和双样本一体化采样对新冠病毒临床检测性能的影响一、检测试剂条制备：同“实验二”制备。
40.二、本发明检测技术层析检测结构制备：同“实验一”制备。
41.三、对照用核酸检测试剂：对照用检测材料：通过rt-qpcr进行核酸检测，产品采用bgi 新冠病毒核酸实时荧光rt-pcr试剂盒（货号mfg030010），于2020年3月获得fda紧急使用授权（eua），包装规格为50个反应/试剂盒，制造商为华大基因，检测仪器为abi 7500荧光定量pcr检测仪、mgisp-960高通量自动提取和液体处理工作站和mgi easy核酸提取试剂盒（货号1000020261）。
42.四、实验方法及结果：对采用本发明检测技术制备的新冠病毒抗原层析检测结构的性能进行评估，并与rt-qpcr的检测结果进行比较。
43.1、样本选择：选择新冠病毒感染疑似病例和感染接触人群，根据rt-qpcr核酸检测结果，将样本分为阳性组和阴性组。同时通过rt-qpcr和抗原层析检测结构检测鼻拭子样本、唾液样本以及本发明唾液与鼻拭子采集物的混合样本，并将两种结果进行分析比较。
44.2、样品收集和处理用于rt-qpcr检测的样本，采用前鼻采样拭子按照说明书要求采样，放入非灭活utm保存液内保存；用于鼻拭子抗原层析检测结构检测的样本，采用本发明鼻腔采样结构采样，放入非灭活utm保存液内保存；用于唾液抗原层析检测结构检测的样本，采用本发明唾液采样结构直接将唾液吐入并收集至唾液收集管内；用于本发明双样本检测技术的样本，采用本发明鼻腔采样结构采集鼻腔样本，采用本发明唾液采样结构直接将唾液吐入并收集至唾液收集管内，然后将鼻腔采样结构直接放入采集的唾液内，搅拌混合并将唾液浸泡吸收至鼻腔采样头上，备用检测。
45.五、结果及分析：总共对85例受试者进行了比对检测，其中37例为临床新冠病毒感染病例，48例为健康人群样本。结果分析如下： 根据图6、图7、图8所示，85例受试者的检测结果，与前鼻采样拭子采样的rt-qpcr检测结果比较，本发明鼻腔采样结构采集的样本用抗原层析检测结构检测的阳性符合率为91.2%，阴性符合率为100%；本发明唾液采样结构采集的样本用抗原层析检测结构检测的阳性符合率为70.3%，阴性符合率为100%；采用本发明双样本检测技术，即取唾液采样结构直接将唾液吐入并收集至唾液收集管内，然后将鼻腔采样结构直接放入采集的唾液内，搅拌
混合并将唾液浸泡吸收至鼻腔采样头上，然后将采样头直接插入抗原层析检测结构内的检测样本采集结构内，启动检测，观察结果，检测的阳性符合率为100%，阴性符合率为100%，与两种单独采样检测技术比较，经统计学分析差异显著, p＜0.01。表明本发明检测技术可以显著提高抗原层析检测结构检测的准确性，同时还不影响检测特异性。

技术特征：
1.一种唾液和鼻腔双样本一体化加样的检测技术，包括如下步骤：采用唾液采样结构将唾液样本采集至唾液采集容器内，采用鼻腔采样结构将采样头伸入鼻腔内采集鼻腔样本，直接将采集有鼻腔样本的所述采样头置入至采集的唾液样本内，搅拌洗脱，形成唾液样本与鼻腔样本的混合液相，并使所述混合液相浸泡吸收到所述鼻腔采样结构的采样头上，然后将所述采样头直接插入设置于层析检测结构上的检测样本采集结构内，所述混合液相被直接加载至与所述检测样本采集结构具有液流交通的检测试纸条的样本垫上，流经标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫，通过观察所述固相层析检测膜上标记物被间接捕获的量，读取检测结果，完成检测过程。2.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述唾液采样结构为设有开口的容器结构。3.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述鼻腔采样结构为前端设置有由吸水材料制备的采样头的棒状结构。4.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述层析检测结构为一种壳状结构，前端设置有采样头插入口，上方设置有观察窗，内部设置有所述检测样本采集结构、检测试剂条放置托槽和位于所述托槽上的所述检测试剂条以及所述检测样本采集结构与检测试剂条之间的液流交通开口，其中所述检测试剂条从所述采样头插入口向远端依次排列所述样本垫、标记物结合垫、固相层析检测膜和吸水垫。5.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述唾液采样结构由漏斗状的上大下小的唾液采集结构和试管状的唾液收集容器结构组成，两者间为可拆装式分体状结构。6.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述鼻腔采样结构为所述采样头与所述采样手柄直接连接并伸出至所述采样手柄外部的插入式结构。7.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述固相层析检测膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、deae纤维素膜的至少一种。8.根据权利要求1所述检测技术，其特征在于：所述标记物结合垫中的标记物选择胶体金属、荧光标记物、乳胶微球的至少一种。9.权利要求1所述检测技术在免疫检测产品的研究开发中的应用。

技术总结
本发明公开了一种唾液和鼻腔双样本一体化加样的检测技术，通过唾液采样结构采集唾液样本，鼻腔采样结构采集鼻腔内样本，将采集有鼻腔样本的鼻腔采样结构采样头放入唾液样本内混合，制成唾液样本与鼻腔样本的混合液并吸收到鼻腔采样结构的采样头上，然后将采样头直接插入层析检测结构的检测样本采集结构内，直接加载混合液至检测试纸条的样本垫上，启动并完成检测过程。本发明可以用于胶体金、荧光免疫、乳胶微球等多种快速免疫检测产品的开发，提高了免疫检测产品的检测效率、便捷性和准确性，具有重要的临床意义。具有重要的临床意义。具有重要的临床意义。


技术研发人员：刘默文 刘杰
受保护的技术使用者：嘉兴康源科泰科技发展有限公司
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25