一种双苯并咪唑荧光染料、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物荧光染料领域，具体涉及一种双苯并咪唑荧光染料化合物、制备方法及其应用，所述荧光染料能够用于dna染色，通过荧光进行dna检测。


背景技术：

2.核酸，分为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，dna)和核糖核酸(ribonucleicacid，rna)，是生命体中的遗传物质。对于核酸合成、转运和加工的时空分布的完整获取对于疾病、健康和外部刺激条件下的细胞功能和行为至关重要。因此，人们在研究活细胞中的核酸探针成像方面付出了巨大的努力。目前，尽管诸如分子信标等寡核苷酸探针手段己经得到了广泛的研究，但是由于具有分子量低、膜透性好、反应快的等诸多优点荧光染色应用于核酸选择性识别时更为方便，受到越来越多的关注。
3.苯并咪唑是一类存在于多种药物中的重要结构单元，许多苯并咪唑类化合物都有重要的生物活性。例如作为dna 拓扑异构酶的抑制剂、hiv 逆转录酶的抑制剂等。此外由于其具有良好的荧光特性还可作为分子探针，例如hoechst33258是具有双苯并咪唑结构的化合物，它对dna 序列具有高度的选择性亲合作用，同时伴有很高的荧光量子产率，因而被广泛地用于基因和细胞荧光测定研究中。除化合物hoechst33258外，hoechst染料还包括化合物hoechst33324，这两种染料关键的不同点在于，hoechst 33342使用乙氧基替换hoechst33258苯环上的羟基，这使它具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜。虽然上述dna染料已经成功进行商业应用，但是仍然存在荧光量子产率需进一步提高、透膜性较低等问题。
4.非专利文献cite this: mol. biosyst., 2013, 9, 2541研究了双/三取代的含有双苯并咪唑结构在不同dna双螺旋结构中的性能。其中研究了双氟取代的化合物在dna结合中的光谱性能变化。
[0005] (dfa)非专利文献european journal of medicinal chemistry 46 (2011) 659-669合成了一系列含有双苯并咪唑结构：
该方法第一步以4-硝基-3-氨基苯腈作为原料，在pd/c催化剂下催化氢化制备得到3,4-二氨基苯腈。然而，本发明在研究过程中发现，若采用该步骤进行反应，在还原氢化过程中氰基会被氢化，从而导致会产生大量的杂质，2,4-二氨基苯胺，一方面降低了反应的收率，另一方面增加了反应的后处理难度。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供更多双苯并咪唑类荧光染料、优化其制备方法更加便于工业使用。通过将f原子引入苯环得到五氟取代的双苯并咪唑荧光染料，所述染料相比于hoechst33342以及上述非专利文献公开的二氟取代双苯并咪唑荧光染料的具有更高的荧光量子产率，更好的透膜性，从而可以实现对dna快速、精准的定位，能够快速标记检测dna。
[0007]
本发明所述的双苯并咪唑荧光染料结构如下所示：式1。
[0008]
除此之外，本发明还提供了一种本发明的双苯并咪唑荧光染料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1）化合物4与化合物5a环合得到化合物6；步骤2）化合物6还原氢化得到化合物7；步骤3）化合物7与化合物8b环合制备得到式1化合物。
[0009]
优选的，步骤中化合物6在pd/c 催化下还原氢化得到化合物7。
[0010]
优选的，化合物5a由3-硝基-4-氨基苯腈在低级醇中盐酸条件下下制备得到：。
[0011]
所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。
[0012]
在本发明的技术方案中，其中，化合物4由以下步骤制备得到：步骤a）将5-氯-2硝基苯胺与甲基哌嗪反应制备得到化合物3；步骤b）化合物3在氢气条件下，pd-c作为催化剂还原制备得到化合物4。
[0013]
在本发明的技术方案中，其中，步骤a）中加入碱性试剂进行反应，所述碱性试剂优
选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠。
[0014]
在本发明的技术方案中，其中，化合物8b由五氟苯腈在低级醇中酸性条件下制备得到。
[0015]
本发明还包括上述荧光染料在制备dna荧光染料中的用途。
[0016]
有益效果：（1）与现有技术中已商业使用的化合物hoechst 33342和hoechst33258相比，本发明的荧光染料具有更高的荧光量子产出效率，能够进一步提高检测的灵敏度和准确性；（2）本发明的荧光染料具有更好的细胞膜通透性，从而可以实现对dna快速、精准的定位，能够快速标记检测dna；（3）本发明的制备方法简单，条件温和，能够以较高的收率获得式1化合物，更有利于工业化生产。
附图说明
[0017]
图1：本发明化合物与化合物hoechst 33342在细胞核内不同时间产生的荧光信号。
具体实施方式
[0018]
实施例1化合物3的制备将 5-氯-2-硝基苯胺（2.59g，15mmol）、甲基哌嗪（1.5g，15mmol）和碳酸钾（2.1g，15mmol）加入dmf中混合，回流至反应完全。将混合物倒入冷水中，用乙酸乙酯萃取，分离有机层，用水洗涤有机层，无水硫酸钠进行干燥、浓缩，硅胶柱层析得到浅黄色固体3g，产率 85%。1h nmr (500 mhz, dmso) δ7.83 (d, 1h), 7.13 (s, 1h), 6.39 (d, 1h), 6.27 (s, 1h), 3.61
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3.53 (t, 2h), 3.47
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3.39 (t, 2h), 2.55 (t, 2h), 2.40 (t, 2h), 2.25 (s, 3h).实施例2化合物4的制备将化合物3（30 g，127mmol）、5%钯炭（18g）加入无水乙醇，室温下、氢气中进行氢化，过滤除去催化剂，蒸干溶剂得到黄棕色沉淀物24.5g， 产率93.5% 。1h nmr (500 mhz, cdcl3) δ = 6.26 (d, 1h), 6.02 (m, 1h), 5.78 (d, 1h), 4.22 (m, 4h), 3.69
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3.59 (t, 2h), 3.53
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3.43 (t, 2h), 2.66
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2.54 (t, 2h), 2.47
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2.38 (t, 2h), 2.29 (s, 3h).实施例3化合物5a的制备将3-硝基-4-氨基苯腈（4.8g，30mmol）溶于无水乙醇中。 冰浴冷却后，向溶液中通入氯化氢气体，保持温度在 0-1
ꢀº
c 之间。 将反应混合物在冰箱（4℃）中保存 4-5 天，得到橙黄色沉淀，过滤并用无水乙醚洗涤得到沉淀7.2g，产率98%。1h nmr (500 mhz, dmso) δ 7.54 (s, 1h), 7.44 (dd, 1h), 6.94 (d, 1h), 3.67 (m, 2h), 1.31 (t, 3h).实施例4化合物6的制备将化合物4（2.62 g，3mmol）和化合物5a（3.83 g，16mmol）加入冰醋酸中，加热搅拌反应2小时。 减压除去过量的乙酸并将残余物溶解在热水中，过滤并通过氨水再沉淀。 将沉淀重新溶解在甲醇和乙酸的混合溶剂中，过滤后用氨水再沉淀，得到棕红色固体4g，收率89%。1h nmr (500 mhz, dmso) δ 8.56 (s, 1h), 8.17 (s, 1h), 7.51 (s, 2h), 7.38 (s, 1h), 7.17 (d, 1h), 7.06 (s, 1h), 6.66 (s, 1h), 3.64
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3.57 (m, 2h), 3.48
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3.41 (m, 2h), 2.59
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2.52 (m, 2h), 2.41
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2.33 (m, 2h), 2.25 (s, 3h).实施例5化合物7的制备将化合物6 （1g，2.8 mmol）、5%钯炭（600mg）加入无水乙醇中，在室温下、氢气中进行氢化，过滤除去催化剂，蒸馏除去溶剂得到浅棕红色固体0.85g，产率94%。1h nmr (500 mhz, dmso): δ 7.37 (d, 1h), 7.23 (dd, 1h), 7.05 (d, 1h), 6.78 (d, 1h), 6.71 (d, 1h), 6.65 (dd, 1h), 5.26 (s, 2h), 4.89 (s, 2h), 3.60 (t, 2h), 3.44 (t, 2h), 2.55 (t, 2h), 2.38 (t, 2h), 2.25 (s, 3h).实施例6化合物8b的制备将五氟苯腈（2.8g，14.6 mmol）溶于无水甲苯，加入无水乙醇。冰浴冷却溶液后，向溶液中通入氯化氢气体，保持温度在0-1
º
c之间。 将反应混合物在冰箱（4℃）中保存1小时，加入无水乙醚得到沉淀，过滤后用无水乙醚洗涤干燥得到粉白色固体4.5g，产率98%。1h nmr (500 mhz, dmso): δ 3.65 (s, 2h), 1.30 (s, 3h).实施例7式i化合物的制备将化合物7（34g，0.105mol）和化合物8b（53.8g，0.169mol）加入到300ml乙酸中，油浴110℃反应3h，tlc检测化合物7是否消失，如果不消失补加化合物8b，反应完成后析出黄色固体。过滤得黄色固体，加入300ml甲醇和2ml氨水中，搅拌，缓慢加入hcl饱和的400ml乙醚，析出黄绿色的粉末，收集固体在甲醇中回流半小时，冷却过滤得亮黄色沉淀，真空干燥得26g， hplc〉99%，hrms(esi)：m/z：[m h] ：499.16。1h nmr (500 mhz, dmso) δ 8.20 (d, 1h), 7.99 (dd, 1h), 7.72 (d, 1h), 7.40 (d, 1h), 7.09 (s, 1h), 6.68 (dd, 1h), 3.64 (t, 2h), 3.48 (t, 2h), 2.58 (t, 2h), 2.42 (t, 2h), 2.26 (s, 3h).实施例8
细胞透膜性试验将式i化合物和hoechst33342在仓鼠卵巢细胞中进行实时染色成像检测。取2μm式i化合物母液和hoechst33342母液分别溶于2ml 卵巢细胞培养基中，孵育0、5、10、15分钟后分别进行荧光共聚焦成像。结果如下附图1所示，根据附图1可知，式i化合物在10分钟时，细胞核内就有荧光信号产生，在15分钟内便能够进行特异性染色，而hoechst33342在15分钟内仅出现少量荧光信号 。上述试验证明式i化合物具有较高的细胞渗透性，能够对细胞进行快速染色，染色速率明显高于hoechst33342。
[0019]
本领域技术人员会理解，本发明不限于这里的实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

技术特征：
1.一种双苯并咪唑荧光染料，其特征在于结构如下所示：
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式1。2.一种权利要求1所述的双苯并咪唑荧光染料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1）化合物4与化合物5a环合得到化合物6；步骤2）化合物6还原氢化得到化合物7；步骤3）化合物7与化合物8b环合制备得到式1化合物。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤中化合物6在pd/c 催化下还原氢化得到化合物7。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：化合物5a由3-硝基-4-氨基苯腈在低级醇中盐酸条件下下制备得到：。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：化合物4由以下步骤制备得到：步骤a）将5-氯-2硝基苯胺与甲基哌嗪反应制备得到化合物3；步骤b）化合物3在氢气条件下，pd-c作为催化剂还原制备得到化合物4。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：化合物8b由五氟苯腈在低级醇中酸性条件下制备得到。8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤a）中加入碱性试剂进行反应，所述碱性试剂选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的任意一种或其组合。9.权利要求1所述的双苯并咪唑荧光染料作为dna荧光探针的用途。

技术总结
本发明涉及一种双苯并咪唑荧光染料、制备方法及其应用。针对现有技术中DNA荧光染料的不足，提供一种结构简单、荧光强度强的荧光染料，并且具有良好的膜透性。本发明的荧光染料能够通过简单的合成步骤制备得到，便于工业化应用。应用。应用。


技术研发人员：杜池敏 李汝娟 程友文 宋艳民
受保护的技术使用者：天津全和诚科技有限责任公司
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25