清酒乳杆菌和水苏糖组合物在制备便秘治疗药物中的应用的制作方法

c
24h42o21
，它由蔗糖的葡萄糖基一侧以 α-1，6 糖苷 键 链 接 两 分 子 半乳糖组成，属于α-低聚半乳糖（α-gos）。
12.在一个优选的实施方案中，所述组合物被制备为被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。
13.第五，本发明提供了上述组合物在制备消化系统功能障碍疾病治疗药物中的应用。
14.在一个优选的实施方案中，所述消化系统功能障碍疾病为便秘。
15.最后，本发明提供了一种含有上述组合物的食品或保健品。
16.本发明是从腐乳中分离纯化得到具有益生菌特性的清酒乳杆菌furu2019，分类命名为清酒乳杆菌lactobacillus sakei，保藏号为cgmcc no.22254，实验证明分离得到的乳酸菌对动物无害，且经动物实验确证具有调节通便功能的功效。清酒乳杆菌furu2019和水苏糖单独和联合均能改善小鼠的便秘症状，其中联合应用组（（st ls组）在小鼠排便数量、粪便湿重和粪便含水量上的改善效果比水苏糖组（st组）和益生菌单一组（ls组）显著（p《0.05），在小鼠首次黑便排出时间和肠道推进率上的改善效果与st组和ls组的效果接近。各干预组主要通过影响水通道蛋白（aqp4和aqp8）和cajal间质细胞（scf和c-kit）表达水平来缓解便秘，其中联合应用组对结肠中aqp4和aqp8表达水平的影响较水苏糖组和益生菌单一组更为显著（p《0.05）。scfas检测结果表明，联合应用组显著增加了盲肠内容物中丙酸和丁酸的丰度。elisa实验结果表明，联合应用组小鼠血清中兴奋性神经递质和激素5-羟色胺（5-ht）、p物质（sp）和胃动素（mtl）含量较模型组显著升高（p《0.05），抑制性神经递质内皮素（et）含量较模型组显著降低（p《0.05）。摄入该菌的小鼠体征正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。
附图说明
17.图1. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠首次黑便排出时间的影响统计图；图2. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠粪便数量的影响统计图；图3. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠粪便湿重的影响统计图；图4. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠粪便含水量的影响统计图；图5. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠肠道推进率的影响统计图；图6. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠血清内皮素（et）的影响统计图；图7. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠血清胃肠道激素胃动素（mtl）的影响统计图；图8. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠血清神经递质p物质（sp）的影响统计图；图9. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠血清抑制性神经递质血管活性肠肽（vip）的影响统计图；图10.水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中水通道蛋白aqp4基因表达水平的影响统计图；图11. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中水通道蛋白aqp8基因表达水平的影响统计图；图12. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中c-kit基因转录水平的影响统计图；图13. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中scf基因转录水平的影响统计图；
图14. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中神经营养因子gdnf基因转录水平的影响统计图；图15. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠结肠中一氧化氮合酶nos基因转录水平的影响统计图；图16. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸乙酸含量的影响统计图；图17. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸丁酸的影响统计图；图18. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸异戊酸的影响统计图；图19. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸戊酸的影响统计图；图20. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸丙酸的影响统计图；图21. 水苏糖和清酒乳杆菌对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸异丁酸的影响统计图。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
19.实施例1 .乳酸菌的分离、筛选和鉴定1.1 清酒乳杆菌furu2019的分离1）配置mrs琼脂培养基经121℃，15min高压灭菌处理后冷却至50℃，轻轻摇匀，混匀后倒入培养皿；2）取自制腐乳标本1g 溶于5ml 1xpbs, 混后取出100ul涂布于mrs培养基上；3）在37℃，0.5% co2环境中培养48h；4）挑取湿润、呈圆形凸起的灰白色单菌落进行转接。
20.1.2 菌种保藏本实验室用含30%甘油的mrs培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：1）将容量为2ml的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；2）细菌在mrs培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入2ml 的无菌保菌液；3）用l棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中；4）将菌液转移到保菌管中，混匀后于-80℃保藏。
21.1.3 菌落外观和菌体形态观察根据16s测序和框架图测序方法鉴定，获得了一株清酒乳杆菌菌株，命名为furu2019，该菌株属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈灰白色、表面光滑、呈圆形凸起。镜下观察清酒乳杆菌细胞形态为杆状。
22.1.4菌株的保藏对清酒乳杆菌菌株furu2019进行保藏，保藏号为cgmcc no.22254，保藏日期为2021年4月28日，保藏分类命名为清酒乳杆菌lactobacillus sakei，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
23.1.5细菌总dna的提取将单个菌落接种于mrs培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组dna提取试剂盒(promega）说明书操作，提取dna。
24.1.6 细菌通用引物16s rdna pcr 扩增细菌16s rrna 鉴定：提取细菌基因组dna，扩增拟杆菌通用引物16s rdna pcr产物并测序，序列在ncbi上进行blast比对，进行初步鉴定。
25.经测序，cgmcc no. 22254菌株的16s rdna如seq id no.1所示，选择ncbi-blast数据库，利用nucleotide-blast在线比对，完成对拟杆菌的初步鉴定。比对结果显示，cgmcc no. 22254菌株的16s rdna序列与清酒乳杆菌（lactobacillus sakei ）1909和zfm 220的序列一致性分别为99.80%和99.52%（见表1）。
26.表1. 16s rrna序列比对结果表。
27.实施例2.清酒乳杆菌furu2019的改善便秘功能评价一、方法和评价指标1. 动物实验：40只spf级6-8周龄成年雄性icr小鼠(24-26克)，适应性喂养七天后，随机分为五组（每组八只）：空白对照组、便秘模型组、水苏糖（2公斤每包，中国食品发酵工业研究院提供）干预组（st）、清酒乳杆菌干预组（ls）、水苏糖 清酒乳杆菌混合干预组（st ls）。空白对照组与模型组每天灌胃0.3ml的pbs，水苏糖干预组灌胃0.3ml的水苏糖溶液（剂量为1.5g/kg，每只小鼠用量约为35mg），清酒乳杆菌干预组灌胃0.3ml的清酒乳杆菌菌液（剂量为3.5
×
109cfu），水苏糖 清酒乳杆菌混合干预组灌胃0.3ml的混合溶液（剂量为1.5g/kg的水苏糖和3.5
×
109cfu的清酒乳杆菌，具体配制为1 mg的水苏糖配比108cfu的清酒乳杆菌，每只小鼠的用量为35 mg的水苏糖和3.5
×
109cfu的清酒乳杆菌）。灌胃14天后，各组小鼠禁食不禁水16小时，于第15天进行小鼠排便实验。排便实验完成后，继续对小鼠禁食不禁水16小时，于第16天进行肠道推进实验。
28.2. 排便实验：灌胃14天后禁食不禁水 16h，次日空白对照组小鼠给pbs，其他组小鼠给10mg/kg的复方地芬诺酯溶液， 30 min 后，各组小鼠均灌胃给予墨水 0.2 ml，恢复正常饮水和摄食，单笼饲养。灌墨水结束开始计时，记录小鼠首粒黑便排出时间。收集小鼠 5 h 内粪便，记录其粒数，称重（湿重 w1），烘箱设置为 100 ℃，连续烘干 2 h，称重（干重 w2），计算小鼠粪便含水量（r）=(w1－w2)/w1
×
100%。
29.3. 肠道推进实验：完成排便实验后禁食不禁水16 h，次日空白对照组小鼠给pbs，其他组小鼠给5mg/kg的复方地芬诺酯溶液，30 min 后，各组小鼠均给予墨水 0.2 ml 灌胃。灌墨水结束开始计时，于 25min 后摘取小鼠眼球取血并快速用颈椎脱臼法处死全部小鼠。剖腹取出直肠末端到幽门的全部肠道，摆正拉直，在无张力状态下测量肠道全长 l1 和
墨水在肠道的推进距离 l2，计算墨水推进距离占肠道全长的百分比并进行统计分析。肠道推进率（d）=l2/l1
×
100%。
30.4. 水通道蛋白基因表达的定量rcr检测：小鼠的结肠组织提取rna，通过反转录获得互补dna。使用表2中给出的引物，使用20微升混合液进行聚合酶链反应，包括正向引物和反向引物各0.8微升，dna模板2微升。每个样本设置两个复孔，平均ct从两次运行中确定)。β-actin基因表达用作内部对照，δct = ct (靶基因)
ꢀ−ꢀ
ct (对照基因），相对基因表达计算为 δδct = δct (治疗)
ꢀ−
δct (空白)。然后，将相对基因表达水平转换为(2
−
δδct)。
31.表2. 定量rcr检测用引物短链脂肪酸分析：盲肠内容物样品采用agilent db-wax 毛细管柱气相色谱系统进行分离。程序升温:初始温度90℃;以10℃/min升温至120℃;再以 5℃/min升温至 150℃;最后以 25℃/min 升温至250℃,并维持2 min。载气为氦气载气流速 1.0 ml/min。 采用agilent 7890a/5975c气-质联用仪进行质谱分析。
32.酶联免疫吸附实验：vip、sp、mtl、et采用血清检测试剂盒(北京颐圣兆博生物科技有限公司)检测。在酶标涂层板上加标准品50μl，待测样品孔中加样品稀释液40μl，待测样品中再加样品10μl。37
°
c孵育30分钟。用洗涤液重复洗涤5次，轻轻拍干。每孔加入酶标试剂
50μl，空白孔除外。孵化和清洗。每孔加显色剂a 50μl，再加显色剂b 50μl，轻轻摇匀，37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μl，终止反应。最后将空孔归零，并在450nm波长处依次测量各孔的吸光度(od值)。
33.16s rdna测序及肠道菌群分析：取30ng合格的基因组dna样品及相应的融合引物，配置pcr反应体系，设置pcr反应参数进行pcr扩增，用agcurt ampure xp磁珠对pcr扩增产物进行纯化，溶解在洗脱缓冲液中，并标记。完成建库。采用agilent 2100生物分析仪检测文库的片段范围和浓度。根据插入片段的大小，选择符合条件的库在hiseq平台上进行测序。
34.统计分析：所有数据的统计分析均使用graphpad prism 5。数据以均数
±
标准差(sd)表示。各组间差异采用单因素方差分析和t检验。
35.二、结果1.st、ls和st ls对小鼠排便参数和小肠推进率的影响小鼠排便实验表明，复方地芬诺酯能有效诱导便秘，模型组的第一次粪便排出时间明显长于空白对照组，粪便数量、粪便湿重、粪便含水量均明显低于空白对照组，表明造模成功。st、ls和st ls灌胃两周小鼠的第一次排便时间显著低于便秘模型组，粪便数量、粪便湿重、粪便含水量均明显高于模型组，证明st、ls和st ls均能有效缓解小鼠便秘(图1-4)。其中st ls混合处理组的粪便湿重（552.4
±
267.16mg）和数量（21.6
±
3.13）显著优于st组（湿重：284.83
±
66.62mg; 数量：16.17
±
3.87）和ls组（湿重252.8
±
45.98mg：数量：14.67
±
2.16）单一处理组(图2，3)。药物诱导便秘后，模型组小鼠肠道因蠕动明显减弱，小肠推进率显著低于空白组。三组干预组均可显著提高肠道蠕动和推进率，且st ls混合组的推进率（57.4
±
7.03%）显著高于st益生菌单一干预组（49.98
±
5.36%）(图5)。该结果表明，st、ls和st ls均对便秘均有缓解作用。
36.2.st组、ls组和st ls组对小鼠肠道激素水平的影响肠道神经递质主要分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质，神经递质可以直接促进或抑制肠道蠕动。本研究主要是测定兴奋性神经递质5-羟色胺（5-ht）、p物质（sp）和胃肠道激素胃动素（mtl）以及抑制性神经递质血管活性肠肽（vip）和内皮素（et），从而探究st组、ls组和st ls组是否能通过影响肠道神经递质含量来恢复肠道功能。与空白组相比（167.87
±
4.57ng/l），便秘模型组（198.98
±
4.36ng/l）小鼠内皮素(et)水平明显升高，st组、l组s和st ls组干预均可不同程度地境地et含量，其中st组干预降低et的效果最显著（175.92
±
3.31ng/l）(图6)。便秘小鼠胃动素(mtl)水平（449.88
±
11.25ng/l）明显低于正常小鼠（473
±
17.1ng/l），st组、ls组的mtl水平都有显著升高，st组小鼠的mtl水平（548.52
±
28.26ng/l）升高最显著 (图7)。便秘组的p物质(sp)（61.05
±
0.76ng/l）含量最低，正常组（63.35
±
1.65）、st组（64.1
±
2.46ng/l）、ls组（68.69
±
2.02ng/l）和st ls组（71
±
0.94ng/l）sp含量均显著高于便秘组，其中st ls混合组显著高于st组和ls组(图8)。便秘模型小鼠的血管活性肠肽(vip)（233.81
±
5.26ng/l）明显高于空白组（207.16
±
6.12ng/l），只有ls组干预能显著降低其含量（224.08
±
2.43ng/l） (p《0.05)，st组和ls st组干预无显著变化(图9)。
37.3.st组、ls组和st ls组对小鼠结肠便秘相关因子mrna水平的影响水通道蛋白（aqps）是一类细胞膜蛋白，它能够通过吸收和分泌水分来控制肠道水
分的平衡。便秘患者往往存在粪便含水量少的问题，这与aqps的异常表达有着十分重要的关系。便秘组小鼠结肠中水通道蛋白aqp4（8.32
±
3.47）和aqp8（35.34
±
23.54）的表达水平明显高于正常小鼠（aqp4:2.33
±
2.08, aqp8:7.73
±
8.21）,st组、ls组和st ls组干预三组干预组中aqp4和aqp8的表达量相似，都显著下降至正常小鼠的水平(图10,11)。cajal间质细胞数量减少可以引起平滑肌收缩障碍从而造成肠道蠕动减弱。cajal间质细胞的发育主要依赖于scf/c-kit信号通路，而干细胞生长因子受体（c-kit）和干细胞因子（scf）是信号通路中的两个重要因子。便秘小鼠结肠中c-kit和scf的表达水平显著低于正常小鼠。st组、ls组和st ls组scf和c-kit的表达均高于模型组(p《0.05)，三个干预组间无显著差异(图12,13)。gdnf是一种胶质细胞来源的神经营养因子，它与肠胃道神经密切相关，因此当gdnf的表达受到抑制时，小鼠的胃肠神经支配将丧失，从而影响肠道蠕动导致便秘。便秘组gdnf表达明显低于正常组(p《0.05)。st组和ls组的gdnf表达均显著高于便秘组(图14)。便秘组小鼠的一氧化氮合酶（nos）表达水平则显著高于空白组小鼠，只有ls干预组显著降低了nos表达而接近空白组(p《0.05)(图15)。
38.4.st组、ls组和st ls组对小鼠短链脂肪酸（scfas）的影响scfas作为一种肠道代谢产物，通过改变肠道ph值促进肠道蠕动。模型组和空白组小鼠的多种短链脂肪酸含量均无显著差异。st组（1105.87
±
147.84
µ
g/g）和ls组（1177.42
µ
g/g
±
198.4）小鼠盲肠内容物中乙酸含量显著高于模型组（779.83
±
178.15
µ
g/g）(p《0.05)（图16）。ls组（291.86
±
80.05
µ
g/g）和st ls组（304.33
±
145.85
µ
g/g）小鼠盲肠内容物中丁酸含量显著高于模型组（134.76
±
69.49
µ
g/g）(p《0.05)（图17）。st组（23.33
±
6.91
µ
g/g）、ls组（18.84
±
6.53
µ
g/g）、ls st组（14.7
±
2.76
µ
g/g）的异戊酸含量均显著高于模型组（10.79
±
1.87
µ
g/g）(p《0.05)（图18）。st组（39.81
±
8.79
µ
g/g）、ls组（37.69
±
5.65
µ
g/g）、ls st组（29.96
±
2.33
µ
g/g）的戊酸含量均显著高于模型组（19.78
±
6.50
µ
g/g）(p《0.05)（图19）。st组（306.86
±
78.30
µ
g/g）、ls组（313.53
±
49.82
µ
g/g）的丙酸含量均显著高于模型组（208.90
±
41.51
µ
g/g）(p《0.05)（图20 ）。st组的异丁酸含量（26.56
±
4.03
µ
g/g）显著高于模型组（20.73
±
2.22
µ
g/g）(p《0.05)（图21）。

技术特征：
1.一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述益生菌的保藏号为cgmcc no.22254，保藏日期为2021年4月28日，保藏分类命名为lactobacillus sakei，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.根据权利要求1所述的乳酸杆菌益生菌株，其特征在于，所述菌株的16s rdna的序列如seq id no：1所示。3.权利要求1或2所述乳酸杆菌益生菌菌株在制备消化系统功能障碍疾病治疗药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述消化系统功能障碍疾病为便秘。5.一种含有权利要求1或2所述乳酸杆菌益生菌菌株的食品或保健品。6.一种含有权利要求1所述乳酸杆菌益生菌菌株的组合物，其特征在于，所述组合物还含有水苏糖。7.根据权利要求6所述的组合物，所述组合物被制备为被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。8.权利要求6所述组合物在制备消化系统功能障碍疾病治疗药物中的应用。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述消化系统功能障碍疾病为便秘。10.一种含有权利要求6所述组合物的食品或保健品。

技术总结
本发明公开了一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.22254，保藏日期为2021年4月28日，保藏分类命名为Lactobacillus sakei（清酒乳杆菌），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示，本发明还公开了所述菌株以及菌株与水苏糖组合物在制备改善消化道功能的食品、保健品和药品中的应用，所述菌株对动物无害，且具有调节改善便秘的功效。的功效。的功效。


技术研发人员：任志鸿 宋利琼 肖玉春 黄元铭
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25