产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用

1.本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体涉及一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用。


背景技术：

2.萜类化合物是最大的一类天然次级代谢产物，包含80000多个已知分子，具有高度的结构多样性和广泛的应用范围。尽管存在这种显着的多样性，但所有萜类化合物均由异戊二烯单元（c5）组成。根据c5单元的数量，萜类化合物一般可分为单萜类（c10）、倍半萜类（c15）、二萜类（c20）、三萜类（c30）和类胡萝卜素（c40），其中以倍半萜类最为丰富。α-葎草烯是一种分子式为c
15h24
的单环倍半萜，由于其抗炎、抗过敏和抗癌活性而具有巨大的应用潜力。
3.目前，α-葎草烯主要通过化学合成或者植物提取法进行工业化生产，然而，植物提取主要受到含量低，易受季节、地理位置等因素限制，这导致提纯等工艺的生产成本较高，化学合成存在步骤繁琐、收率低、催化剂昂贵和环境污染等缺陷也使其发展受到限制。因此，异源微生物合成作为生产α-葎草烯的替代方法受到越来越多的关注，近年来，α-葎草烯已经成功在多种宿主中实现了异源生产，但是所得的产量仍然很低，导致生产效率低、达不到工业化应用的要求。
4.随着代谢工程和合成生物学的快速发展，微生物正发展成为高附加值天然化合物绿色工业化生产的有效平台。解脂耶氏酵母是一种被认为是安全的（gras）非常规产油酵母，近年来在解脂耶氏酵母中成功开发了多种高效的合成生物学工具，为解脂耶氏酵母的基因操作提供了方便，因而越来越受到人们的关注。但是以解脂耶氏酵母为宿主进行萜类合成的研究还主要集中在细胞质中，这不利于探索解脂耶氏酵母生产萜类的潜力，阻碍了其工业化应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用，该重组菌株能够实现双细胞器产α-葎草烯或者角鲨烯，具有较高的产量，发酵成本低。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因，或者分别含有编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因。
7.本发明第二方面提供一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量；其中，所述增强α-葎草烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因，所述增强角鲨烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因。
8.本发明第三方面提供一种发酵产萜类化合物的方法，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯，该方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照上述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。
9.本发明第四方面提供上述的重组菌株或上述的方法在制备萜类化合物中的应用，其中，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯。
10.通过上述技术方案，本发明提供的重组菌株能够有效提高α-葎草烯或者角鲨烯的产量，且具有原料再生、条件温和、绿色生产，不受时间、地点约束等优点。
11.在本发明最优选实施方式中，以解脂耶氏酵母为宿主菌株获得的重组菌株在发酵0h时添加50μm的硫酸铜溶液，发酵后得到的α-葎草烯含量为96mg/g dcw，更加显著提高了发酵效果以及α-葎草烯的产率。
12.生物保藏本发明的解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）gq3007，于2022年3月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为cgmcc），保藏编号为cgmcc no.24525。
附图说明
13.图1是实施例2中各编码基因转入出发菌株的流程图。
具体实施方式
14.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
15.本发明使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平（例如出发菌株中的水平）增加至少10%，例如增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括增加100%、或相比参比水平增加在10%到100%之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。
16.第一方面，本发明提供了一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α-葎
草烯或者角鲨烯，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中增强α-葎草烯合酶的活性的方式为：所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因；所述细胞质和过氧化物酶体中增强α-葎草烯合酶的活性的方式为：所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因。
17.本发明中，优选情况下，所述出发菌株为解脂耶氏酵母菌（yarrowia lipolytica），更优选为敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌，所述编码基因ku70的核苷酸序列如seq id no：27所示。示例性地，以购自于美国菌种保藏中心（atcc）的解脂耶氏酵母菌株mya2613为原始菌株，敲除了负责非同源重组的编码基因ku70，编码基因ku70的核苷酸序列如seq id no：27所示，得到yarrowia lipolytica po1fδku70（mata，ura3-302，leu2-270，xpr2-322，axp2-delta，nu49，xpr2::suc2 mya2613δku70::hisg），可作为本发明所述的出发菌株。
18.本发明中，为了提高重组菌株的α-葎草烯产量，优选地，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中均含有编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因，进一步优选地，所述α-葎草烯合酶的编码基因achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示；为了提高重组菌株的角鲨烯产量，优选地，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中均含有编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因，进一步优选地，所述角鲨烯合酶的编码基因erg9的核苷酸序列如seq id no：4所示。本发明的发明人发现，以敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌为出发菌株，在其重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别外源引入α-葎草烯合酶（achs2）基因表达盒，能够更加显著地提高发酵产物α-葎草烯的产量；分别外源引入角鲨烯合酶（erg9）基因表达盒，能够更加显著地提高发酵产物角鲨烯的产量。
19.本发明中，所述重组菌株用于生产α-葎草烯时，基于细胞质和过氧化物酶体中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，还可以进一步将其所述角鲨烯合酶的编码基因erg9替换为铜离子抑制型启动子ctr2；其中，所述铜离子抑制型启动子ctr2的核苷酸序列如seq id no：5所示。本发明的发明人发现，将角鲨烯合酶的编码基因erg9替换为铜离子抑制型启动子ctr2，能够进一步提高重组菌株生产α-葎草烯的产量。
20.本发明中，所述重组菌株的细胞质中实现甲羟戊酸途径增强，可以通过对出发菌株的细胞质内甲羟戊酸途径的任意一个关键酶的编码基因进行过表达来实现，所述重组菌株的过氧化物酶体中实现甲羟戊酸途径增强，可以通过对过氧化物酶体中甲羟戊酸途径的任意一个关键酶的编码基因进行有效表达来实现。优选地，所述重组菌株的细胞质中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的编码基因thmg1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因erg8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因erg20、甲羟戊酸激酶的编码基因erg12、羟甲基戊二酰-coa合酶的编码基因erg13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因erg19、乙酰乙酰辅酶a硫解酶的编码基因erg10
和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因idi中的至少一种；所述重组菌株的过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi中的至少一种；其中，所述编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi的核苷酸序列分别如seq id no：6-13所示。
21.需要说明的是，为了能够更好地将上述编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi定位至出发菌株的过氧化物酶体中，实现其各自在过氧化物酶体中的有效表达，编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi在导入过氧化物酶体时，各自连接有作为过氧化物酶体定位信号的短肽，包含7个氨基酸组成的序列，具体为gggsskl，其对应的核苷酸序列可以为ggtggtggttcttctaaacta。
22.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入coa-乙酰化醛脱氢酶的编码基因aad、醛脱氢酶的编码基因aldh、肉碱乙酰转移酶的编码基因cat2、amp脱氨酶的编码基因ampd、atp柠檬酸裂解酶的编码基因acl1、acl2、磷酸酮醇酶的编码基因pk和磷酸转乙酰酶的编码基因pta中的至少一种；其中，所述编码基因aad、aldh、cat2、ampd、acl1、pk、pta的核苷酸序列分别如seq id no：14-20所示，所述编码基因acl2的核苷酸序列分别如seq id no：29所示。
23.本发明中，优选地，所述重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中过表达3-酮酰基-coa硫解酶的编码基因pot1、过氧化物酶体多功能酶i型的编码基因mef1、过氧化物酶体生物发生因子10的编码基因pex10中的至少一种和/或敲除过氧化物酶体苹果酸合酶的编码基因mis1和过氧化物酶体柠檬酸合酶的编码基因cit2中的至少一种；其中，所述编码基因pot1、mef1、pex10、mis1和cit2的核苷酸序列分别如seq id no：21-25所示。
24.需要说明的是，本发明中，在乙酰辅酶a的通量增强的同时，还进一步过表达atp的载体蛋白的编码基因ant，以能够为过氧化物酶体提供足够的能量，编码基因ant的核苷酸序列如seq id no：28所示。
25.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还分别通过外源引入关键限速酶的编码基因nadh-thmg1，编码基因nadh-thmg1的核苷酸序列如seq id no：26所示。
26.本发明中，优选地，用于生产α-葎草烯的重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中，在引入编码基因nadh-thmg1的基础上，进一步过表达α-葎草烯合酶的编码基因achs2；用于生产角鲨烯的重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中，在引入编码基因nadh-thmg1的基础上，进一步过表达角鲨烯合酶的编码基因erg9。
27.需要说明的是，为了能够更好地将编码基因nadh-thmg1定位至出发菌株的过氧化物酶体中，实现其在过氧化物酶体中的过表达，编码基因nadh-thmg1在导入过氧化物酶体时，连接有作为过氧化物酶体定位信号的短肽，包含7个氨基酸组成的序列，具体为gggsskl，其对应的核苷酸序列可以为ggtggtggttcttctaaacta。
28.根据本发明优选的实施方式，所述重组菌株的保藏编号为cgmcc no.24525。
29.本发明第二方面提供了一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊
酸途径和乙酰辅酶a的通量；其中，所述增强α-葎草烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因，所述增强角鲨烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因。
30.本发明中，优选地，所述α-葎草烯合酶的编码基因achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述角鲨烯合酶的编码基因erg9的核苷酸序列如seq id no：4所示。本发明中，α-葎草烯合酶的活性增强通过在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别通过外源引入achs2表达盒来实现，角鲨烯合酶的活性增强通过在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别通过外源引入erg9表达盒来实现。
31.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中α-葎草烯合酶的活性增强时，将所述角鲨烯合酶的编码基因erg9替换为铜离子抑制型启动子ctr2；其中，所述铜离子抑制型启动子ctr2的核苷酸序列如seq id no：5所示。将erg9替换为ctr2的过程基于同源重组的原理，在内源性启动子的上下游分别获取同源臂，中间表达ctr2，转入基因组时发生同源重组，即替换完成。
32.本发明中，优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母菌，优选为敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌，所述编码基因ku70的核苷酸序列如seq id no：27所示。
33.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质中所述甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的编码基因thmg1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因erg8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因erg20、甲羟戊酸激酶的编码基因erg12、羟甲基戊二酰-coa合酶的编码基因erg13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因erg19、乙酰乙酰辅酶a硫解酶的编码基因erg10和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因idi中的至少一种；所述重组菌株的过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi中的至少一种；其中，所述编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi的核苷酸序列分别如seq id no：6-13所示。
34.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入coa-乙酰化醛脱氢酶的编码基因aad、醛脱氢酶的编码基因aldh、肉碱乙酰转移酶的编码基因cat2、amp脱氨酶的编码基因ampd、atp柠檬酸裂解酶的编码基因acl1、acl2、磷酸酮醇酶的编码基因pk和磷酸转乙酰酶的编码基因pta中的至少一种；其中，所述编码基因aad、aldh、cat2、ampd、acl1、pk、pta的核苷酸序列分别如seq id no：14-20所示，所述编码基因acl2的核苷酸序列分别如seq id no：29所示。
35.本发明中，优选地，所述重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中过表达3-酮酰基-coa硫解酶的编码基因pot1、过氧化物酶体多功能酶i型的编码基因mef1、过氧化物酶体生物发生因子10的编码基因pex10中的至少一种和/或敲除过氧化物酶体苹果酸合酶的编码基因mis1和过氧化物酶体柠檬酸合酶的编码基因cit2中的至少一种；其中，所述编码基因pot1、mef1、pex10、mis1和cit2的核苷酸序列分别如seq id no：21-25所示。
36.本发明中，优选地，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还通过外源引入关键限速酶的编码基因nadh-thmg1，编码基因nadh-thmg1的核苷酸序列如seq id no：26所
示。
37.本发明中，过表达指的是在菌株中插入细胞中本身存在的基因，使得该基因上调表达，终基因表达产物超过正常水平；敲除指的是将菌株细胞中存在的某个基因失活或者不表达；外源引入指的是将外源的功能基因（目标细胞的基因组原先不存在、或已失活的基因）转入细胞的基因组中，在细胞内获得表达。本发明中，过表达、敲除和外源引入均利用基因同源重组的方法，在指定的位点设置上同源臂和下同源臂，在两个同源臂之间放入想要表达的基因表达框，或者不放任何基因（主要用于敲除）。
38.本发明中，上述的编码基因的过表达、敲除或者外源引入，均可以通过本领域内常规的方法实现。例如，上述过表达的编码基因均可以先构建相应的重组载体后在大肠杆菌中复制，然后再按照一定的顺序导入感受态的出发菌株中。本领域已知构建重组载体的各种方法，以用来将目的基因片段（例如编码基因erg8）连接至表达载体来制备重组载体，例如但不限于，经典的“酶切-连接”方法、invitrogen公司开发的gateway克隆系统以及诺唯赞公司开发的clonexpress克隆系统（诸如，clonexpress multis one step cloning kit试剂盒）。
39.示例性地，编码基因erg8可采用重组酶方法构建得到本发明的重组载体：基于出发菌株（如敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌株mya2613）的基因组，采用pcr方法扩增得到靶向插入部位的上下游同源臂序列；将待插入目的基因表达框、上下游同源臂序列及抗性基因表达盒等串联连接，得到重组载体，但本发明不限于此。
40.随后，可采用本领域的常规方法将该重组载体导入出发菌株（如敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌株mya2613）中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化（例如电转化）。上述显微注射、基因枪或转化均为本领域常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源dna接触，从而使外源dna进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法。
41.本发明中，以敲除非同源重组的编码基因ku70的解脂耶氏酵母菌株mya2613作为出发菌株时，在将重组载体导入出发菌株之后，可通过筛选标记（例如抗性基因）筛选出阳性克隆，并通过基因组pcr进行验证、或者通过对基因组dna测序进行验证，从而得到所述的产萜类化合物的重组菌株。例如，可以采用zymo research生产的frozen-ez yeast transformation ii kit酵母转化试剂盒，进行感受态细胞制备和转化的过程。
42.本发明第三方面提供了一种发酵产萜类化合物的方法，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯，该方法包括：将如前所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照如前所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。
43.本发明中，优选地，先将所述重组菌株制备成种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
44.本发明中，优选地，所述种子液的制备方法包括：挑取所述重组菌株的单菌落接种于种子培养基中进行种子培养，得到所述种子液。
45.本发明中，对所述种子培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的用于制备解脂耶氏酵母菌种子液的种子培养基，优选地，所述种子培养基为ypd液体培养基。
46.本发明中，优选地，所述种子培养的条件包括：转速为200-250rpm，温度为25-35℃，时间为16-24h。本发明中，优选地，所述重组菌株的单菌落可以选自在固体平板上进行划线培养的菌落。示例性地，将所述重组菌株接种至ypd固体平板上划线，温度为25-35℃条件下培养2-3天获得所述重组菌株的单菌落。
47.本发明中，对所述发酵的方法没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵产萜类化合物的方法，例如将所述种子液接种至发酵培养基中（例如装有所述发酵培养基的摇瓶或发酵罐中）进行发酵培养得到发酵液。
48.本发明中，为了提高α-葎草烯或者角鲨烯的产率，优选地，相对于100体积份的所述发酵培养基，所述种子液的接种量为0.5-2体积份。
49.本发明中，所述发酵的条件包括；温度为25-35℃，转速为200-250rpm，时间为80-120h。示例性地，为了提高α-葎草烯的产率，所述发酵的条件可以为：先在转速为200-250rpm，温度为25-35℃的条件下发酵20-30h；然后加入正十二烷，继续在转速为200-250rpm，温度为25-35℃的条件下发酵60-84h，得到发酵液。进一步优选地，相对于100体积份的所述发酵培养基，所述正十二烷的添加量为20-30体积份。正十二烷的添加能够实时萃取、收集分泌到细胞外的α-葎草烯，在发酵结束后离心取十二烷层，即可获得α-葎草烯。本发明中，优选地，所述发酵培养基包含碳源、有机氮源（例如酵母粉、蛋白胨）。更优选地，所述发酵培养基的组分及含量为：蛋白胨15-25g/l、酵母粉8-12g/l、葡萄糖50-70g/l。本发明中，优选地，重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中将角鲨烯合酶的编码基因erg9替换为铜离子抑制型启动子ctr2时，发酵培养基中还含有铜盐，以进一步提高重组菌株发酵过程中α-葎草烯的产率。具体地，发酵培养基中铜盐的含量为5-500μm。
50.本发明中，可以通过已知的方法分离所得发酵液中的α-葎草烯或者角鲨烯。例如，α-葎草烯可以被菌株分泌至细胞外，通过将所述发酵液中的细胞除去，然后将除去细胞后的发酵液进行浓缩使产物结晶，或进行离子交换层析等诸如此类的方法分离；角鲨烯存在于菌体内，则通过将所述发酵液中的菌体收集，然后进行冷冻干燥，称取一定量的菌体，与氢氧化钠-甲醇溶液混合、震荡反应后，再与浓硫酸混合，最后与十二烷混合、震荡后离心，将角鲨烯提取至十二烷层内。
51.本发明中，还可以通过已知方法对所述发酵液中的α-葎草烯或者角鲨烯进行检测，或者对所述发酵液中分离得到的α-葎草烯或者角鲨烯进行检测。例如，可以通过气相色谱法和诸如此类的方法来对α-葎草烯或者角鲨烯进行检测。
52.本发明第四方面提供了上述的重组菌株或上述的方法在制备萜类化合物中的应用，其中，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯。
53.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。以下实施例中，除非另有说明，所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，或按照制造厂家建议的条件。
54.以下实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法；在无特殊说明的情况下，室温为25
±
5℃。
55.以下实施例中，出发菌株为yarrowia lipolytica po1f δku70（mata，ura3-302，leu2-270，xpr2-322，axp2-delta，nu49，xpr2::suc2 mya2613δku70::hisg），其以购自于美国菌种保藏中心（atcc）的解脂耶氏酵母菌株mya2613为原始菌株，参考文献“gao s ,
tong y ,zhu l ,etal.iterative integration of multiple-copy pathway genes in yarrowialipolytica for heterologousβ-carotene production[j].metabolic engineering,2017:192”中所述的方法，敲除了负责非同源重组的编码基因ku70，编码基因ku70的核苷酸序列如seq id no：27所示，得到yarrowia lipolytica po1fδku70。
[0056]
1、培养基与试剂ypd液体培养基：蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖20g/l；ypd固体培养基：蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉20g/l；ypd
60
发酵培养基：蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖60g/l、硫酸铜8mg/l。
[0057]
2、α-葎草烯或者角鲨烯的含量通过气相色谱仪（gc）进行检测：气相色谱仪的型号：日本岛津 qp2020nx，hp-5ms色谱柱（30m
×ꢀ
320μm
ꢀ×ꢀ
0.5μm）。
[0058]
α-葎草烯的检测条件：进样口温度250℃，进样体积1μl，分流比为20：1；色谱柱：hp-5ms（30m
×ꢀ
0.25mm）；色谱条件：初始温度为60℃，按照10℃/min的速度上升到150℃，然后20℃/min上升到280℃，保持2min；用α-葎草烯的标准品进行定性定量。
[0059]
角鲨烯的检测条件：进样口温度250℃，进样体积1μl，分流比为20：1；色谱柱：hp-5（30m
ꢀ×ꢀ
320μm
ꢀ×ꢀ
0.25μm）；色谱条件：175℃升温3min，20℃/min升温至200℃保温3min，20℃/min升温至260℃保温4min；用角鲨烯的标准品进行定性定量。
[0060]
3、基因片段的扩增（pcr扩增方法）pcr扩增中所用pcr酶为takara的primestar maxdna聚合酶；pcr扩增体系如下表1：表1 pcr扩增体系试剂使用量终浓度primestarmax（2
×
）25μl1
×
primer110-15pmol0.2-0.3μmolprimer210-15pmol0.2-0.3μmoltemplate＜200ng 灭菌蒸馏水upto50μl 其中，pcr扩增的过程为：在98℃条件下变性处理10s，在55℃条件下退火10s后，在72℃条件下进行延伸，重复35个循环后，用axypreptm dna gel extraction kit（购自康宁生命科学（吴江）有限公司）纯化回收各片段；其中，延伸时间=目标片段长度/1kb，单位min。
[0061]
4、重组载体的构建（一步克隆法）：利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpress multis one step cloning kit实现一步克隆，反应体系如表2所示，将反应体系在50℃条件下孵育15min后，得到环状的重组载体；表2 一步克隆体系组分重组反应线性化载体xμln个插入片段y1 y2
…
ynμl2
×
clonexpressmix5μl
ddh2oto10μl将环状的重组载体转化至大肠杆菌dh5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落pcr及测序验证，得到阳性重组质粒。
[0062]
实施例1原件质粒的构建根据ncbi上提供的解脂耶氏酵母菌（y.lipolytica）中的乳清酸核普-5'-磷酸脱浚酶编码基因ura的核苷酸序列（genebank登录号aj306421.1）和hisg标签（genebank登录号af324729.1），委托擎科生物科技有限公司合成，将两个hisg标签编码基因序列插入质粒puc中，具体使用puc57作为骨架，使用ecori和hindiii酶切后回收骨架，将hisg标签编码基因采用clonexpress multis one step cloning kit实现一步克隆，构建得到质粒puc-hisg-hisg，再以此为骨架，采用hindiii酶切后回收骨架，将ura编码基因采用clonexpress multis one step cloning kit实现一步克隆，构建得到两个hisg标签编码基因序列中，使得在两个hisg标签编码基因序列中插入乳清酸核-5'-磷酸脱羚酶编码基因，以便实现ura标记回收，得到质粒puc-huh；将上述构建过程中的hisg片段替换成bilk（xm_023576916.1）即可得到骨架质粒puc-bub。
[0063]
解脂耶氏酵母内源性基因和表达原件的克隆（1）解脂耶氏酵母基因组的提取：提取解脂耶氏酵母po1f的全基因组dna（提取dna的方法参见酵母基因组dna提取试剂盒的说明书，购自生工生物工程上海有限公司）。
[0064]
（2）以步骤（1）获得的解脂耶氏酵母基因组为模板，分别设计相应的引物对，通过pcr扩增方法克隆以下12个内源性的编码基因、6个启动子和14个终止子，详见下述整合质粒的构建过程；nadh-hmg1（来自玫瑰杆菌ruegeria pomeroyi）、achs2（从植物沉香中分离出来）、gfp（人工合成）、cit2的同源臂（内源性）、mis1的同源臂（内源性）、ampd、acl2、acl1、pk（来自肠膜明串珠菌leuconostoc mesenteroides）、cat2（来自酿酒酵母saccharomycescerevisiae）、aad（来自大肠杆菌e. coli）、aldh（来自escherichiacoli）均经过密码子优化后委托擎科生物科技有限公司合成。
[0065]
整合质粒的构建（1）整合质粒puc-intc-huh-thmg1-erg13-idi的构建
①
以原件质粒puc-huh为骨架，用intc-up-f和intc-up-r经pcr扩增（如表1所示）得到intc上同源臂intc-up，将puc-huh骨架用ecori酶切后与intc-up进行一步克隆（如表2所示）连接，得到puc-huh-intc-up；
②
用intc-dn-f和intc-dn-r经pcr扩增得到下同源臂intc-dn，将puc-huh-intc-up用hindiii酶切后与intc-dn进行一步克隆连接得到puc-huh-intc；
③
用t
thmg1t-f和t
thmg1t-r经pcr扩增得到t
thmg1t
，用thmg1-f和thmg1-r经pcr扩增得到thmg1，用p
tefin-f和p
tefin-r经pcr扩增得到p
tefin
，将puc-huh-intc用hindiii酶切后与t
thmg1t
、thmg1和p
tefin
进行一步克隆连接，得到puc-huh-intc-thmg1；
④
用t
erg13t-f和t
erg13t-r经pcr扩增得到t
erg13t
，用erg13-f和erg13-r经pcr扩增得到erg13，用p
gpd-f和p
gpd-r经pcr扩增得到p
gpd
，将puc-huh-intc-thmg1用xbai酶切后与
t
erg13t
、erg13和p
gpd
进行一步克隆连接，得到puc-intc-huh-thmg1-erg13；
⑤
用t
idit-f和t
idit-r经pcr扩增得到t
idit
，用idi-f和idi-r经pcr扩增得到idi，用p
exp-f和p
exp-r经pcr扩增得到p
exp
，将puc-intc-huh-thmg1-erg13用xbai酶切后与t
idit
、idi和p
exp
进行一步克隆连接，得到puc-intc-huh-thmg1-erg13-idi，其中所涉及的引物核苷酸序列如表3所示，thmg1的核苷酸序列如seq id no：6所示，erg13的核苷酸序列如seq id no：10所示，idi的核苷酸序列如seq id no：13所示。
[0066]
可参见puc-intc-huh-thmg1-erg13-idi的具体构建过程获得后续其他整合质粒。
[0067]
表3intc-up-fgttgtaaaacgacggccagtgaattcaggttgtcgatgatatgctgintc-up-ratgcaccactggaagatccgggaattaggacaactcctgagacataintc-dn-faacagcttaattaaggtaccaagcttcgtggttcatgtccttcatctintc-dn-rtgaccatgattacgccaagctgtcgagttgcggctcgagagcctthmg1t-ftggaacagcttaattaaggtaccaagctcaggtcgtctcgatcaaatccttgtthmg1t-ratatttgcatacggtcataggtgtacaatagtgaaggaaathmg1-ftttccttcactattgtacacctatgaccgtatgcaaatatthmg1-rctttttgcagtactaaccgcagacccagtctgtgaaggtggttgaptefin-faccaccttcacagactgggtctgcggttagtactgcaaaaptefin-rgatgaaggacatgaaccacgaagctctagaagagaccgggttggcggcgtatterg13t-fatacgccgccaacccggtctcttctagggagtaacagcacgtatcgcacgtterg13t-ragtacgagatcaagcagtagattgttaagatgcaactaggerg13-fcctagttgcatcttaacaatctactgcttgatctcgtacterg13-rgaattaaacacacatcaacaatgtcgcaaccccagaacgttggaapgpd-facgttctggggttgcgacattgttgatgtgtgtttaattcaagaatpgpd-ragatgaaggacatgaaccacgaagctctagacgcagtaggatgtcctgcactidit-fgtgcaggacatcctactgcgtctaggactcgatactactccagtcatidit-rttcggcggtggatcaagtagggattggcgaagtaattaatidi-fattaattacttcgccaatccctacttgatccaccgccgaaidi-rcacaagacatatctacagcaatgacgacgtcttacagcgapexp-ftcgctgtaagacgtcgtcattgctgtagatatgtcttgtgpexp-rcagatgaaggacatgaaccacgaagctctagacacacgtttcggtgagtatgag（2）整合质粒puc-ku70-huh-erg20-erg12以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体ku70位点上游1542bp、下游1489bp的序列；在ku70-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化；将线性化puc-huh-ku70质粒依次插入erg20和erg12表达框，最终得到整合质粒puc-ku70-huh-erg20-erg12，其中所涉及的引物核苷酸序列如表4所示，erg20的核苷酸序列如seq id no：8所示，erg12的核苷酸序列如seq id no：9所示。
[0068]
表4
ku70-up-fgctatgaccatgattacgatatttaaatcccaaagacgaggagactttct
ku70-up-ratgcaccactggaagatccggaattcacgcgaagttgggtgccatgttku70-dn-fcctgattgactggaacagccccaagcttggtgatgccatcgaggaatggaku70-dn-rtaaaacgacggccagtgccgatatttaaatgcaagcacaagaaggagcctcgcttcagterg20t-ftttacaagcgacagaagtagacacttgaaaaaaacgcaatterg20t-rcattcctcgatggcatcaccaagcttctagaaggactcgggtcagaagttctterg20-fgaattaaacacacatcaacaatgtccaaggcgaaattcgaerg20-rattgcgtttttttcaagtgtctacttctgtcgcttgtaaapgpd-fctgattgactggaacagccccaagctcgcagtaggatgtcctgcacgpgpd-rtcgaatttcgccttggacattgttgatgtgtgtttaattcterg12t-ftcggtccctggacccattagtatttaattttaatgagtgaterg12t-rcattcctcgatggcatcaccaagcttctagacgaggtattgctgtctataaerg12-fcacaagacatatctacagcatctagcatggactacatcatttcggcgcerg12-rtcactcattaaaattaaatactaatgggtccagggaccgapexp-fagaacttctgacccgagtccttctagcacacgtttcggtgagtatgagpexp-rgcgccgaaatgatgtagtccatgctagatgctgtagatatgtcttgtg
（3）整合质粒puc-scp2-huh-erg10-erg8-erg19以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf
‑ꢀ
scp2中的染色体scp2位点上游1523bp、下游1524bp的序列；在scp2-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化；将线性化puc-huh-scp2质粒依次插入erg10、erg8、erg19表达框，最终得到整合质粒puc-scp2-huh-erg10-erg8-erg19，其中所涉及的引物核苷酸序列如表5所示，erg10的核苷酸序列如seq id no：12所示，erg8的核苷酸序列如seq id no：7所示，erg19的核苷酸序列如seq id no：11所示。
[0069]
表5整合质粒puc-scp2-huh-erg10-erg8-erg19的引物核苷酸序列scp2-up-fgttgtaaaacgacggccagtgaattcccgacagtcgtctgcaccccscp2-up-ratgcaccactggaagatccgggaatttttgtgtaatgaataagagascp2-dn-faacagcttaattaaggtaccaagcttcaagtcccccaagggtgatgscp2-dn-rgaccatgattacgccaagctgcggccgcaaccgatagtgagactcaatterg10t-faggtctcttctgtcgagtagttagtatatagatgatttatterg10t-rcatcacccttgggggacttgaagcttggacaattaatttgtcgcgterg10-facaaactaacccagctcttccgactcactctgccccgacterg10-rataaatcatctatatactaactactcgacagaagagacctpfbain-fgaacagcttaattaaggtaccaagctgtacgtagcaacaacagtgtpfbain-ragtcggggcagagtgagtcggaagagctgggttagtttgtterg8t-ftcgagaaggggttcaagtagcactgtgacaatgagaaggaterg8t-rcatcacccttgggggacttgaagcttgaaacataatgcataactgterg8-fgagtataagaatcattcaaaatgaccacctattcggctccerg8-rtccttctcattgtcacagtgctacttgaaccccttctcgaptef-faacgcgacaaattaattgtccaagctagagaccgggttggcggcgtptef-rggagccgaataggtggtcattttgaatgattcttatactc
terg19t-fgacagttatgcattatgtttcaagcttggagcccgttgagggagatterg19t-rctctgaagaacagcaagtaggcagggggcagaaacaagaaerg19-fttcttgtttctgccccctgcctacttgctgttcttcagagerg19-racaaactaacccagctcttcatgatccaccaggcctccacpfbain-fgtggaggcctggtggatcatgaagagctgggttagtttgtpfbain-rgcatcacccttgggggacttgaagctgtacgtagcaacaacagtgt（4）整合质粒puc-intd-huh-2thmg1以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体intd位点上游1442bp、下游1189bp的序列；在intd-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化；将线性化puc-huh-intd质粒依次插入两个thmg1表达框，最终得到整合质粒puc-intd-huh-2thmg1，其中所涉及的引物核苷酸序列如表6所示，thmg1的核苷酸序列如seq id no：6所示。
[0070]
表6
intd-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaataacctcatttcatctgaattgaintd-up-rggtatagtacaatgattacgaattccggatcttccagtggtgcatgintd-dn-ftgattgactggaacagccccaagcttagagaacagaacaagtcggaagintd-dn-rtgtttatgttactcgatttcatttaaatagcttggcgtaatcatggtcatagcttthmg1t-faggtatagtacaatgattacgaattccaggtcgtctcgatcaaatcctthmg1t-ratatttgcatacggtcataggtgtacaatagtgaaggaaathmg1-f1tttccttcactattgtacacctatgaccgtatgcaaatatthmg1-r1ttttgcagtactaaccgcagacccagtctgtgaaggtggtptefin-faccaccttcacagactgggtctgcggttagtactgcaaaaptefin-rcatgcaccactggaagatccggaattagagaccgggttggcggcgttxpr2t-fatatttgcatacggtcatagattaagatccaactacggaacttgtgtxpr2t-rcttccgacttgttctgttctctaagcttgacacgggcatctcacttgcthmg1-f2cacaagacatatctacagcattaatatgacccagtctgtgaaggtggttgathmg1-r2cacaagttccgtagttggatcttaatctatgaccgtatgcaaatatpexp-fccctgattgactggaacagccccaagctggagtttggcgcccgtttttpexp-rtcaaccaccttcacagactgggtcatattaatgctgtagatatgtcttgtg
（5）整合质粒puc-intf-huh-2achs2以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体intf位点上游1610bp、下游1852bp的序列；在intf-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-intf质粒依次插入两个achs2表达框，最终得到整合质粒puc-intf-huh-2achs2，其中所涉及的引物核苷酸序列如表7所示，achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示。
[0071]
表7
intf-up-fgttgtaaaacgacggccagtgaattcagtggtaattcagcaagaccintf-up-rtgcaccactggaagatccgggaattcgccctccaagctacatctacintf-dn-fgattgactggaacagcttaattaaggtaccaagcttgcacaagcctctctataatc
intf-dn-rgaccatgattacgccaagctgcggccgcaggacgacaacggctggtgatcyc1t-faacagcttaattaaggtaccaagcttgcaaattaaagccttcgagctcyc1t-rttcatcccttcaccatctaatcatgtaattagttatgtcaachs2-f1tgacataactaattacatgattagatggtgaagggatgaaachs2-r1accagcactttttgcagtactaaccgcagtctcctgcacaggcgccccaptefin-ftggggcgcctgtgcaggagactgcggttagtactgcaaaaagtgctggtptefin-rtagagaggcttgtgcaagctgctagcagagaccgggttggcggcgttmig1t-fttcatcccttcaccatctaacactggccggtcgataattttmig1t-raaaagattatagagaggcttgtgcaagctgctagaaacccaaaagggccgaaggachs2-f2cacaagacatatctacagcactagcatgtctcctgcacaggcgccccaachs2-r2aaattatcgaccggccagtgttagatggtgaagggatgaapexp-fatacgccgccaacccggtctctgctagcccgtcgcttccacaggctctpexp-rtggggcgcctgtgcaggagacatgctagtgctgtagatatgtcttgtg
（6）整合质粒puc-huh-inte1-pk-pta以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体inte1位点上游1352bp、下游1852bp的序列；在intf-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh
‑ꢀ
inte1质粒依次插入pk和pta表达框，最终得到整合质粒puc-huh-inte1-pk-pta，其中所涉及的引物核苷酸序列如表8所示，pk的核苷酸序列如seq id no：19所示，pta的核苷酸序列如seq id no：20所示。
[0072]
表8
inte1-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattggcaggctggttaccgaatcinte1-up-rtgcaccactggaagatccgggaattcaagtgaacagcgcacgatctinte1-dn-fcactgcactaccactacaccggtaccaagcttggctaacgagagaaactgggccaainte1-dn-raaacagctatgaccatgattacgccaagcttacgcgtatgtcacgtgatggatttctcyc1t-fagatcgtgcgctgttcacttgaattcgcaaattaaagccttcgagctcyc1t-rcatggtctccattaaaataatcatgtaattagttatgtcapk-ftgacataactaattacatgattattttaatggagaccatgpk-rcacaagacatatctacagcagccaccatggctgatttcgattctaapexp-fttagaatcgaaatcagccatggtggctgctgtagatatgtcttgtgpexp-ratgcaccactggaagatccgggaattggtaggtagacaatttactttpex10t-faagcacaagctcaaggttaatgacgaggtctggatggaagtpex10t-rttctctcgttagccaagcttggtaccagacaagtacaagctgacctpta-fttttgcagtactaaccgcagaagttgatggaaaacatcttpta-rcttccatccagacctcgtcattaaccttgagcttgtgcttptefin-fattgactggaacagcttaattaaggtacagagaccgggttggcggcgtptefin-raagatgttttccatcaacttctgcggttagtactgcaaaa
（7）整合质粒puc-huh-inte2-acl1-acl2-ampd以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf-inte2中的染色体inte2位点上游1533bp、下游1521bp的序列；在inte2-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte2质粒依次插入
acl1、acl2、ampd表达框，最终得到整合质粒puc-huh-inte2-acl1-acl2-ampd，其中所涉及的引物核苷酸序列如表9所示，ampd的核苷酸序列如seq id no：17所示，acl1的核苷酸序列如seq id no：18所示，acl2的核苷酸序列如seq id no：29所示。
[0073]
表9inte2-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattcacctgtggctaatttgggainte2-up-rcatgcaccactggaagatccgggaattcgtcttagtgcagcaaaatcginte2-dn-fataccctgattgactggaacagcttaatgtgtggattgcgatattgaainte2-dn-racagctatgaccatgattacgccaagcttcaccctttctctatctctgtampdt-fataccctgattgactggaacagcttaatgtgtgtttactgcacagccttampdt-rttgagcggctgcatggttaattataagcatgtacttgtatampd-fatacaagtacatgcttataattaaccatgcagccgctcaaampd-rcacaagacatatctacagcaatgccgcagcaagcaatggapexp-ftccattgcttgctgcggcattgctgtagatatgtcttgtgpexp-rttcaatatcgcaatccacacaagcttttaattaaggtaggtagacaatttactttacl2t-fccactcctctcggagtttaacttgcccatgagcgagcgaatacl2t-racttcaatatcgcaatccacacaagcttcaccctttaaaccctcccttacl2-factccccgacaatgtactaacacaggtctcagcgaaatccattcacgaacl2-rttcgctcgctcatgggcaagttaaactccgagaggagtggpgpdin-fagtaaattgtctacctaccttaattaagacgcagtaggatgtcctgcapgpdin-rtcgtgaatggatttcgctgagacctgtgttagtacattgtcggggagttacl1t-faggccaagactcgatcatagatctagggtgatagaatatatacl1t-ratatcgcaatccacacaagcttggtaccagccattaaggagttcatttacl1-fctctctacacaaactaacccagctcttcatgtctgccaacgagaacatacl1-rtatattctatcaccctagatctatgatcgagtcttggcctpfbain-fgggagggtttaaagggtgattaaggtacgtacgtagcaacaacagtgtpfbain-ratgttctcgttggcagacatgaagagctgggttagtttgtgtagagag（8）整合质粒puc-inte5-huh-percat2以原件质粒puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体inte5位点上游2138bp、下游2035bp的序列；在inte5-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte5质粒依次插入percat2表达框，最终得到整合质粒puc-inte5-huh-percat2，其中所涉及的引物核苷酸序列如表10所示，cat2的核苷酸序列分别如seq id no：16所示。
[0074]
表10
inte5-up-fgacgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatagctggactctggcaagctcinte5-up-raccactggaagatccgggaattgcggccgctgcaattcccgaaccattinte5-dn-ftggaacagcttaattaaggtaccaagcttcaccttcagtccgcatattinte5-dn-racagctatgaccatgattacgccaagctatttaaatatccctttcaagttgctacttpex10t-faacgaaaagcaaagttatgatgacgaggtctggatggaagtpex10t-raaatatgcggactgaaggtgaagcttagacaagtacaagctgacct
percat2-fgagtataagaatcattcaaaatgaggatctgtcattcgagpercat2-rcttccatccagacctcgtcatcataactttgcttttcgttptef-ftggaacagcttaattaaggtaccaagctagagaccgggttggcggcgtptef-rctcgaatgacagatcctcattttgaatgattcttatactc
（9）整合质粒puc-intc1-huh-aad以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体intc1位点上游1698bp、下游1642bp的序列得到puc-intc1-huh；在intc1-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-intc1质粒依次插入aad表达框，最终得到整合质粒puc-intc1-huh-aad，其中所涉及的引物核苷酸序列如表11所示，aad的核苷酸序列分别如seq id no：14所示。
[0075]
表11intc1-up-faaaacgacggccagtgaattatttaaatctgctgccttactgtcgactintc1-up-rccactggaagatccgggaattgcggcccgcgtagcagaaccgtagatgintc1-dn-fttgactggaacagcttaattaaggtaccagtcgtgggagcaacagggcintc1-dn-rattacgccaagcttggtaccatttaaatggagcgacagttgctcaatctylcyc1t-fatcatctacggttctgctacgcggccgccgaggtggttggagatggactylcyc1t-ratgcgtttcgcattgtttaagatcctaagcgtctacaactggacccttaad-faagggtccagttgtagacgcttaggatcttaaacaatgcgaaacgcataad-rcacacaagacatatctacagcaggatccatgaatcaacaggatattgapexp-ftcaatatcctgttgattcatggatcctgctgtagatatgtcttgtgtgpexp-rggaagatccgggaattgcggcccacgtgccgtcgcttccacaggctct（10）整合质粒puc-intc1-huh-aldh以puc-intc1-huh为骨架，在intc1-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-intc1质粒插入aldh表达框，最终得到整合质粒puc-intc1-huh-aldh，其中所涉及的引物核苷酸序列如表12所示，aldh的核苷酸序列分别如seq id no：15所示。
[0076]
表12tylcyc1t-fatcatctacggttctgctacgcggccgccgaggtggttggagatggactylcyc1t-rtctggataagcctggaggcctgagatcctaagcgtctacaactggaccaldh-fggtccagttgtagacgcttaggatctcaggcctccaggcttatccagaaldh-rcacacaagacatatctacagcaggatccatgaattttcatcatctggcpexp-fgccagatgatgaaaattcatggatcctgctgtagatatgtcttgtgtgpexp-rggaagatccgggaattgcggcccacgtgccgtcgcttccacaggctct（11）整合质粒puc-intf3-huh-idi-pts-erg19-pts-achs2-pts以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf染色体intf3位点上游2113bp、下游2006bp的序列；在intf3-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶noti酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-intf3质粒依次插入idi-pts、erg19-pts、achs2-pts表达框，最终得到整合质粒puc-intf3-huh-idi-pts-erg19-pts-achs2-pts，其中所涉及的引物核苷酸序列如表13所示，pts为过氧化物酶体的信号肽，分别接在idi、
erg19、achs基因的c端，具体为ggtggtggttcttctaaacta；idi、erg19、achs2的核苷酸序列分别如seq id no：13、11和3所示。
[0077]
表13intf3-up-fgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatgtgctgttcagaagccggcintf3-up-ractggaagatccgggaattgcggccgcatacgcgagttcccaaagcagintf3-dn-fctggaacagcttaattaaggtaccaagcttctggggaccgagaattagintf3-dn-rcagctatgaccatgattacgccaagctatttaaatggggcgctccctgtgggcctidit-ftctgctttgggaactcgcgtatgcggccgactcgatactactccagtctidit-rggtggtggttcttctaaactataaggattggcgaagtaattaatidi-fttatagtttagaagaaccaccacccttgatccaccgccgaatctidi-rcacaagacatatctacagcaatgacgacgtcttacagcgapexp-ftcgctgtaagacgtcgtcattgctgtagatatgtcttgtgpexp-rcactggaagatccgggaattgcggccgccacacgtttcggtgagtatgterg19t-fcatactcaccgaaacgtgtggcggcctggagcccgttgagggagatterg19t-rggtggtggttcttctaaactataggcagggggcagaaacaagaaerg19-fctatagtttagaagaaccaccacccttgctgttcttcagagaacerg19-racaaactaacccagctcttcatgatccaccaggcctccacpfbain-fgtggaggcctggtggatcatgaagagctgggttagtttgtpfbain-rcactggaagatccgggaattgcggccgcgtacgtagcaacaacagtgttxpr2t-facactgttgttgctacgtacgcggccgcgacacgggcatctcacttgctxpr2t-rggtggtggttcttctaaactataagtaggatccaactacggaacachs2-fttatagtttagaagaaccaccaccgatggtgaagggatgaaccaachs2-rttttgcagtactaaccgcagtctcctgcacaggcgccccaptefin-ftggggcgcctgtgcaggagactgcggttagtactgcaaaaptefin-raccactggaagatccgggaattgcggccagagaccgggttggcggcgt（12）整合质粒puc-7h-huh-erg10-pts-erg13—pts-thmg1-pts以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体7h位点上游1698bp、下游1642bp的序列；在7h-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-7h质粒依次插入erg10-pts、erg13-pts、thmg1-pts表达框，最终得到整合质粒puc-7h-huh-erg10-pts-erg13-pts-thmg1-pts，其中所涉及的引物核苷酸序列如表14所示，pts为过氧化物酶体的信号肽，分别接在erg10、erg13、thmg1基因的c端，具体为ggtggtggttcttctaaacta；erg10、erg13、thmg1的核苷酸序列分别如seq id no：12、10和6所示。
[0078]
表14
7h-up-fgacgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatcagtacgagtatcttcactc7h-up-rtgcaccactggaagatccgggaattcaacaccgtccccggctggga7h-dn-fccctgattgactggaacagcttaattaattctggacgttcttgttaag7h-dn-rttacgccaagcttggtaccttatttaaatccgtgaaaatcccgtgatctxpr2t-fggtggtggttcttctaaactatgagtaggatccaactacggaacttgt
txpr2t-rtgcaccactggaagatccgggaattgacacgggcatctcacttgcnadh-hmgr-fcagcactttttgcagtactaaccgcagaccggcaagacaggacacanadh-hmgr-rtcatagtttagaagaaccaccaccggtgttttccaaaacctgctptefin-ftcccagccggggacggtgttgaattcagagaccgggttggcggcgtptefin-rtgtgtcctgtcttgccggtctgcggttagtactgcaaaaagtgctgterg13t-fcgcaagtgagatgcccgtgtcaattcggagtaacagcacgtatcgcterg13t-rggtggtggttcttctaaactataaattgttaagatgcaactaggerg13-fttatagtttagaagaaccaccaccctgcttgatctcgtactttcerg13-rgaattaaacacacatcaacaatgtcgcaaccccagaacgtpgpd-facgttctggggttgcgacattgttgatgtgtgtttaattcpgpd-rtgcaccactggaagatccgggaattgcgcagtaggatgtcctgcacterg10t-fggtggtggttcttctaaactataattagtatatagatgatttatterg10t-ratgcaccactggaagatccgggaattggacaattaatttgtcgcgterg10-facaaactaacccagctcttccgactcactctgccccgacterg10-rttatagtttagaagaaccaccaccctcgacagaagagaccttctpfbain-fccgtgcaggacatcctactgcgcaattcgtacgtagcaacaacagtgtpfbain-ragtcggggcagagtgagtcggaagagctgggttagtttgt
（13）整合质粒puc-intf2n-huh-erg12-pts-erg8-pts-erg20-pts以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体intf2n位点上游1698bp、下游1642bp的序列；在intf2n-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-intf2n质粒插入erg12-pts、erg8-pts、erg20-pts表达框，最终得到整合质粒puc-intf2n-huh-erg12-pts-erg8-pts-erg20-pts，其中所涉及的引物核苷酸序列如表15所示，pts为过氧化物酶体的信号肽，分别接在erg12、erg8、erg20基因的c端，具体为ggtggtggttcttctaaacta；erg12、erg8、erg20的核苷酸序列分别如seq id no：9、7和8所示。
[0079]
表15intf2n-up-facgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatgaaatagtcatggtggataintf2n-up-rtgcaccactggaagatccgggaattctaaaaccccagatccaagtcintf2n-dn-fggaacagcttaattaaggtaccaagcttcatcccatagtgttgaaggtintf2n-dn-racagctatgaccatgattacgccaagctatttaaataccaaatcacactatcaaterg20t-fggtggtggttcttctaaactatagacacttgaaaaaaacgcaatterg20t-rtacgccgccaacccggtctctgaattaggactcgggtcagaagttcerg20-fgaattaaacacacatcaacaatgtccaaggcgaaattcgaerg20-rctatagtttagaagaaccaccacccttctgtcgcttgtaaatctpgpd-fgacttggatctggggttttagaattccgcagtaggatgtcctgcacpgpd-rtcgaatttcgccttggacattgttgatgtgtgtttaattcterg12t-fggtggtggttcttctaaactataatatttaattttaatgagtgaterg12t-ratgcaccactggaagatccgggaattgaggtattgctgtctataacerg12-fcacacaagacatatctacagcatctagcatggactacatcatttcggcerg12-rttatagtttagaagaaccaccaccatgggtccagggaccgatgt
pexp-ftggacttggatctggggttttagaattccacacgtttcggtgagtatgpexp-rgccgaaatgatgtagtccatgctagatgctgtagatatgtcttgtgtgterg8t-fggtggtggttcttctaaactatagcactgtgacaatgagaaggaterg8t-rtcatactcaccgaaacgtgtggaattgaaacataatgcataactgterg8-fgagtataagaatcattcaaaatgaccacctattcggctccerg8-rctatagtttagaagaaccaccacccttgaaccccttctcgagccptef-ftggacttggatctggggttttagaattcagagaccgggttggcggcgtptef-rggagccgaataggtggtcattttgaatgattcttatactc（14）整合质粒puc-inte4-bub-2nadh-thmg1-pts-ant以puc-bub为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体inte4位点上游2078bp、下游2023bp的序列；在inte4-up和bilk之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte4质粒依次插入两个nadh-thmg1-pts表达框，在inte4-dn和bilk之间用takara公司的限制性内切酶noti酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-bub-inte4-2nadh-thmg1-pts质粒插入ant表达框，最终得到整合质粒puc-inte4-bub-2nadh-thmg1-pts-ant，其中所涉及的引物核苷酸序列如表16所示，pts为过氧化物酶体的信号肽，分别接在nadh-thmg1基因的c端，具体为ggtggtggttcttctaaacta；nadh-thmg1的核苷酸序列如seq id no：26所示，ant的核苷酸序列如seq id no：28所示。
[0080]
表16
inte4-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatgccgctacaattccgaccctainte4-up-raatgaagtgttccaccctagaattcgtttaaactcccctccccacggtgatgginte4-dn-fagcggcatggagtcgagaccgcggccgccaccgagggatagggaacacinte4-dn-rcgaggtaccgagctcgaattgcggccatttaaataggctgtcaggtgtcgtttgatgtxpr2t-faccgtggggaggggagtttaaacgaattgacacgggcatctcacttgctxpr2t-rggtggtggttcttctaaactatgagtaggatccaactacggaacttgtnadh-hmgr-f1tcatagtttagaagaaccaccaccggtgttttccaaaacctgctnadh-hmgr-r1accagcactttttgcagtactaaccgcagaccggcaagacaggacacaptefin-ftgtgtcctgtcttgccggtctgcggttagtactgcaaaaagtgctggtptefin-raagtgttccaccctagggagaccgaattagagaccgggttggcggcgttlip1t-fggtggtggttcttctaaactatgaaattcggttcatgagaagattlip1t-raagtgttccaccctagggagaccgaattagttggaagatatgatggccnadh-hmgr-f2cccaacacaacaccacagtagaattatgaccggcaagacaggacacatnadh-hmgr-r2tcatagtttagaagaaccaccaccggtgttttccaaaacctgctpilv5-faatacgccgccaacccggtctctgaattaggagcgggagcggagttgapilv5-ratgtgtcctgtcttgccggtcataattctactgtggtgttgtgttgggtantt-fccaccttgatcaagggataagaatagacaagacattgtagtantt-rgtgttccctatccctcggtggcggccctctggccacaacatgccctant-fcacaagacatatctacagcaatggcagctatttccaaagaant-rctacaatgtcttgtctattcttatcccttgatcaaggtggpexp-fagcggcatggagtcgagaccgcggccgcccgtcgcttccacaggctct
pexp-ragtctttggaaatagctgccattgctgtagatatgtcttgtgt
（15）整合质粒puc-inta-bub-2achs2-pts-pot1以puc-bub为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体inta位点上游1641bp、下游1608bp的序列；在inta-up和bilk之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inta质粒插入achs2-pts表达框，在inta-dn和bilk之间用takara公司的限制性内切酶noti酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-bub-inta-achs2-pts质粒插入achs2-pts和pot1表达框，最终得到整合质粒puc-inta-bub-2achs2-pts-pot1，其中所涉及的引物核苷酸序列如表17所示，pts为过氧化物酶体的信号肽，分别接在achs2基因的c端，具体为ggtggtggttcttctaaacta；achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示，pot1的核苷酸序列如seq id no：21所示。
[0081]
表17
inta-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatggcctgtgattgggagctgggatginta-up-raatgaagtgttccaccctagaattcgtttaaaccgtcgcactcggccgatatgginta-dn-fcgaagcggcatggagtcgagaccgcggccgctggggctggcgtgtgaaggainta-dn-rcgaggtaccgagctcgaattgcggccatttaaattatcctcacttgggtacagttgtxpr2t-fcggccgagtgcgacggtttaaacgaattgacacgggcatctcacttgctxpr2t-rggtggtggttcttctaaactataagtaggatccaactacggaacachs2-f1ttatagtttagaagaaccaccaccgatggtgaagggatgaaccaachs2-r1agcactttttgcagtactaaccgcagtctcctgcacaggcgccccaptefin-ftggggcgcctgtgcaggagactgcggttagtactgcaaaaagtgctptefin-rtgttccaccctagggagaccgaattcagagaccgggttggcggcgttpex20t-fggtggtggttcttctaaactataaggaagtgtggatggggaagttpex20t-rtccttcacacgccagccccagcggccaagctttcaagagctgggatachs2-f2cacaagacatatctacagcaatgtctcctgcacaggcgccccaggtachs2-r2ttatagtttagaagaaccaccaccgatggtgaagggatgaaccapexp-fggaccgaagcggcatggagtggccgcccgtcgcttccacaggctcttcgpexp-racctggggcgcctgtgcaggagacattgctgtagatatgtcttgtgtlip1t-fctctggttgttgccgagtaactagcggttcatgagaagataaatatattlip1t-rgaagagcctgtggaagcgacgggcggccagttggaagatatgatggccpot1-fgaattaaacacacatcaacaatggaccgacttaacaacctpot1-ratatatttatcttctcatgaaccgctagttactcggcaacaaccagagpgpd-fggcatggagtcgagaccgcggccgcgacgcagtaggatgtcctgcacgpgpd-raggttgttaagtcggtccattgttgatgtgtgtttaattc
（16）整合质粒puc-erg9-huh-ctr2以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体erg9位点上游2100bp、下游1700bp的序列；在dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-erg9质粒插入p
ctr2
，最终得到整合质粒puc-erg9-huh-ctr2，其中所涉及的引物核苷酸序列如表18所示，ctr2的核苷酸序列如seq id no：5所示，erg9的核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0082]
表18
up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatggctgggtgctgctgaccttup-rtgcaccactggaagatccgggaattctcgacgtggggataattgaadn-faacagcttaattaaggtaccaagctatgggaaaactcatcgaactdn-rgctatgaccatgattacgccaagcttatttaaatcagaaagagattctagatcapctr2-fattaaggtaccaagcttgcggccgcaccaatgaccatccagtaaapctr2-rcgatgagttttcccatgcggccatccatgcttccgtggtcgt（17）整合质粒puc-inte3-huh-pex10以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体inte3位点上游1900bp、下游1800bp的序列；在inte3-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte3质粒插入pex10表达框，最终得到，整合质粒puc-inte3-huh-pex10，其中所涉及的引物核苷酸序列如表19所示，pex10的核苷酸序列如seq id no：23所示。
[0083]
表19inte3-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatctacttgtagctgatctcctinte3-up-rtgcaccactggaagatccgggaattcgtttaaactgtttgatgtcttgagtttginte3-dn-fttaattaaggtaccaagcttgcggccgcgtatacccaatgtacttgtainte3-dn-ragctatgaccatgattacgccaagctatttaaattacaagtacttgcagtcgattlip1t-facttgttgcctatcagataactagcggttcatgagaagataaatatattlip1t-ratgcaccactggaagatccgggaattagttggaagatatgatggccpex10-ftgagtataagaatcattcaaagctagatgtggggaagttcacatgcpex10-ratatatttatcttctcatgaaccgctagttatctgataggcaacaagtptef-faaacagtttaaacgaattcagagaccgggttggcggcgtaptef-rgcatgtgaacttccccacatctagctttgaatgattcttatactca（18）整合质粒puc-inte3-huh-pot1以puc-inte3-huh为骨架，在inte3-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte3质粒插入pot1表达框，最终得到整合质粒puc-inte3-huh-pot1，其中所涉及的引物核苷酸序列如表20所示，pot1的核苷酸序列如seq id no：21所示。
[0084]
表20tlip1t-fctctggttgttgccgagtaactagcggttcatgagaagataaatattlip1t-ratgcaccactggaagatccgggaattagttggaagatatgatggccpot1-ftctgagtataagaatcattcaaagctagatggaccgacttaacaacctpot1-ratatttatcttctcatgaaccgctagttactcggcaacaaccagagptef-faaacagtttaaacgaattcagagaccgggttggcggcgtaptef-raggttgttaagtcggtccatctagctttgaatgattcttatactcaga（19）整合质粒puc-inte3-huh-mfe以puc-inte3-huh为骨架，在inte3-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶ecori酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化。将线性化puc-huh-inte3质粒插入mfe表达框，最终得到整合质粒puc-inte3-huh-mfe，其中所涉及的引物核苷酸序列如表21所示，mfe
的核苷酸序列如seq id no：22所示。
[0085]
表21tlip1t-fccaaggatgctaagctctaactagcggttcatgagaagataaatattlip1t-ratgcaccactggaagatccgggaattagttggaagatatgatggccmfe-ftgagtataagaatcattcaaagctagatgtctggagaactaagatamfe-ratatttatcttctcatgaaccgctagttagagcttagcatccttggptef-faaacagtttaaacgaattcagagaccgggttggcggcgtaptef-rtatcttagttctccagacatctagctttgaatgattcttatactca（20）整合质粒puc-mis1-huh以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的mis基因上游2004bp、下游2012bp的序列，得到整合质粒puc-mis1-huh，其中所涉及的引物核苷酸序列如表22所示，mis1的核苷酸序列如seq id no：24所示。
[0086]
表22mis-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatgtaggtggaatcgacaaccgmis-up-rcatgcaccactggaagatccgggaattcagcgacgtttgaggtttgtgmis-dn-fggaacagcttaattaaggtacctctagagtgggatgacgaagagtattmis-dn-rtgaccatgattacgccaagcttggtaccatttaaatatgctcccagtgagttctca（21）整合质粒puc-cit2-huh以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的cit2基因上游2045bp、下游2266bp的序列整合质粒puc-cit2-huh，得到整合质粒puc-cit2-huh，其中所涉及的引物核苷酸序列如表23所示，cit2的核苷酸序列如seq id no：25所示。
[0087]
表23
cit2-up-fcgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatagctaacacagtgcgttccacit2-up-rcatgcaccactggaagatccgggaattcgcaaataatgacttacgaatcit2-dn-fggaacagcttaattaaggtacctctagagattgatatttcagatttgtcit2-dn-rtatgaccatgattacgccaagcttggtaccatttaaattctctgagaacatgcccatc
（22）整合质粒puc-intc3-huh-2achs2以puc-huh为骨架，插入y. lipolytica polf的染色体intc3位点上游2142bp、下游2135bp的序列；在intc3-up和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化，插入一个achs2表达框，在intc3-dn和hisg之间用takara公司的限制性内切酶hindiii酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化，再插入一个achs2表达框，最终得到整合质粒puc-intc3-huh-2achs2，其中所涉及的引物核苷酸序列如表24所示，achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示。
[0088]
表24intc3-up-facgttgtaaaacgacggccagtgaattatttaaatactagctaatagttcttgtintc3-up-rtgcaccactggaagatccgggaattctacagtgtctatcaacggggintc3-dn-fctgattgactggaacagcttaattaaaagcttgccatagcactattgtagagintc3-dn-racagctatgaccatgattacgccaagctatttaaataggaccgcattctcatttgtcyc1t-fttcatcccttcaccatctaatcatgtaattagttatgtca
tcyc1t-rgccactctacaatagtgctatggcaagcttggtacgcaaattaaagccttcgagcachs2-f1ccagcactttttgcagtactaaccgcagtctcctgcacaggcgccccaachs2-r1tgacataactaattacatgattagatggtgaagggatgaaptefin-fttgactggaacagcttaattaaggtaccagagaccgggttggcggcgtptefin-rtggggcgcctgtgcaggagactgcggttagtactgcaaaaagtgctggtxpr2t-fccccgttgatagacactgtagaattcgacacgggcatctcacttgctxpr2t-rttcatcccttcaccatctaagtaggatccaactacggaacttgtgtachs2-f2acacaagttccgtagttggatcctacttagatggtgaagggatgaaachs2-r2cacaagacatatctacagcaatgtctcctgcacaggcgccccapexp-ftggggcgcctgtgcaggagacattgctgtagatatgtcttgtgpexp-rcactggaagatccgggaattgcggccgcccgtcgcttccacaggctct需要说明的是，表3至表24每个表格中的引物具有特异性，只针对表格所对应的整合质粒质粒的构建，比如表3、表4、表14和表15中均含有引物p
gpd-f，但是针对不同的整合质粒，引物p
gpd-f的核苷酸序列是不一样的。
[0089]
实施例2重组菌株的构建将出发菌株yarrowia lipolytica po1f δku70在ypd液体培养基中培养12h，至od600为0.8，利用zymo research corporation生产的zymogen frozen ez yeast transformation kit ii试剂盒将实施例1中获得的22个整合质粒转入出发菌株中，进行同源重组，制备感受态细胞，每个整合质粒转入后，均采用筛选培养基进行筛选，并利用pcr鉴定正确的阳性克隆。
[0090]
需要说明的是，实施例1中获得的整合质粒puc-huh-inte1-pk-pta、puc-huh-inte2-acl1-acl2-ampd、puc-inte5-huh-percat2、puc-intc1-huh-aad和puc-intc1-huh-aldh属于与重组菌株的细胞质中乙酰辅酶a的通量增强相关的重组载体，其可选择一者转入或者选择多者转入；同样地，整合质粒puc-inte3-huh-pex10、puc-inte3-huh-pot1、puc-inte3-huh-mfe、puc-mis1-huh和puc-cit2-huh属于重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶a的通量增强相关的重组载体，其也可选择一者转入或者选择多者转入。
[0091]
本实施例中，各编码基因转入出发菌株yarrowia lipolytica po1f δku70的流程如图1所示，具体地，将实施例1中获得的整合质粒转入出发菌株的顺序为：puc-intf-huh-2achs2、puc-intc-huh-thmg1-erg13-idi、puc-ku70-huh-erg20-erg12、puc-scp2-huh-erg10-erg8-erg19、puc-intd-huh-2thmg1、puc-intc3-huh-2achs2、puc-intc3-huh-2achs2、puc-intc1-huh-aad、puc-intf3-huh-idi
‑ꢀ
pts-erg19-pts-achs-pts、puc-7h-huh-erg10-pts-erg13-pts-thmg1-pts、puc-intf2n-huh-erg12-pts-erg8-pts-erg20-pts、puc-inte4-bub-2nadh-thmg1-pts-ant、puc-inta-bub-2achs2-pts-pot1、puc-erg9-huh-ctr2，最终获得重组菌株yarrowia lipolyticagq3007，于2022年3月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24525。
[0092]
实施例3（1）发酵生产α-葎草烯将重组菌株gq3007在ypd固体培养基的平板上划线，培养2-3d后，挑取单菌落至
ypd液体培养基中，于30℃、220rpm条件下培养，得到重组菌株种子液，然后将重组菌株种子液以1%体积比的接种量接种于50ml的ypd
60
发酵培养基中，在温度为30℃、转速为220rpm条件下震荡培养24h后，加入ypd
60
发酵培养基体积25%的正十二烷，继续震荡培养72h，得到gq3007发酵液。
[0093]
将出发菌株yarrowia lipolytica po1f δku70、解脂耶氏酵母菌株mya2613、重组菌株gq1001、重组菌株gq1014分别按照上述方法进行发酵，得到相应的发酵液。
[0094]
（2）发酵培养产物分析将重组菌株gq3007、出发菌株yarrowia lipolytica po1f δku70、解脂耶氏酵母菌株mya2613、重组菌株gq1001、重组菌株gq1014对应的发酵液，分别转移至50ml离心管中，8000rpm离心5min，收集上层有机相，过膜，检测α-葎草烯的产量，结果见表25；收集菌体，冷冻干燥，称取干燥菌体的质量，计算细胞干重dcw，结果见表25；定量称取10mg干燥菌体的粉末，用500μl浓度为0.5m甲醇钠（溶于纯甲醇的氢氧化钠）重悬菌体，在室温条件下以1200rpm的转速震荡2h，然后加入40μl的浓硫酸中和，再加入400μl十二烷提取角鲨烯，在室温下震荡10min，离心，收集十二烷层，过膜，用gc-ms分析重组菌株中的角鲨烯，结果见表25。
[0095]
表25
菌株dcw（g/l）α-葎草烯的产量（mg/gdcw）角鲨烯含量（mg/gdcw）重组菌株gq3007259668.3出发菌株yarrowialipolyticapo1fδku7028013解脂耶氏酵母菌株mya261327.5016重组菌株gq100127.50.737重组菌株gq10143046.769.5
通过表25的结果可以看出，本发明提供的重组菌株gq3007中，α-葎草烯的产量明显提高，且具有原料再生、条件温和、绿色生产，不受时间、地点约束等优点。
[0096]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶a的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如seq id no：1所示的α-葎草烯合酶的基因，或者分别含有编码氨基酸序列如seq id no：2所示的角鲨烯合酶的基因。2.根据权利要求1所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述α-葎草烯合酶的编码基因achs2的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述角鲨烯合酶的编码基因erg9的核苷酸序列如seq id no：4所示。3.根据权利要求2所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中α-葎草烯合酶的活性增强时，将所述角鲨烯合酶的编码基因erg9替换为铜离子抑制型启动子ctr2；其中，所述铜离子抑制型启动子ctr2的核苷酸序列如seq id no：5所示。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的细胞质中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的编码基因thmg1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因erg8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因erg20、甲羟戊酸激酶的编码基因erg12、羟甲基戊二酰-coa合酶的编码基因erg13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因erg19、乙酰乙酰辅酶a硫解酶的编码基因erg10和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因idi中的至少一种；所述重组菌株的过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi中的至少一种；其中，所述编码基因thmg1、erg8、erg20、erg12、erg13、erg19、erg10和idi的核苷酸序列分别如seq id no：6-13所示；和/或，所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入coa-乙酰化醛脱氢酶的编码基因aad、醛脱氢酶的编码基因aldh、肉碱乙酰转移酶的编码基因cat2、amp脱氨酶的编码基因ampd、atp柠檬酸裂解酶的编码基因acl1、acl2、磷酸酮醇酶的编码基因pk和磷酸转乙酰酶的编码基因pta中的至少一种；其中，所述编码基因aad、aldh、cat2、ampd、acl1、pk、pta的核苷酸序列分别如seq id no：14-20所示，所述编码基因acl2的核苷酸序列分别如seq id no：29所示；所述重组菌株的过氧化物酶体中乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中过表达3-酮酰基-coa硫解酶的编码基因pot1、过氧化物酶体多功能酶i型的编码基因mef1、过氧化物酶体生物发生因子10的编码基因pex10中的至少一种和/或敲除过氧化物酶体苹果酸合酶的编码基因mis1和过氧化物酶体柠檬酸合酶的编码基因cit2中的至少一种；其中，所述编码基因pot1、mef1、pex10、mis1和cit2的核苷酸序列分别如seq id no：21-25所示；和/或，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还通过外源引入关键限速酶的编码基因nadh-thmg1，编码基因nadh-thmg1的核苷酸序列如seq id no：26所示。5.根据权利要求1至3中任意一项所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述
id no：21-25所示；和/或，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中还通过外源引入关键限速酶的编码基因nadh-thmg1，编码基因nadh-thmg1的核苷酸序列如seq id no：26所示。9.一种发酵产萜类化合物的方法，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯，其特征在于，该方法包括：将权利要求1至5中任意一项所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照权利要求6至8中任意一项所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。10.权利要求1至5中任意一项所述的重组菌株或权利要求6-8中任意一项所述的方法在制备萜类化合物中的应用，其中，所述萜类化合物为α-葎草烯或者角鲨烯。

技术总结
本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用。该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于出发菌株，重组菌株的多个细胞器中分别增强α-葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量；其中，重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，细胞质和过氧化物酶体中分别含有编码α-葎草烯合酶的基因，或者分别含有编码角鲨烯合酶的基因。本发明提供的重组菌株能够有效提高α-葎草烯或者角鲨烯的产量，且具有原料再生、条件温和、绿色生产，不受时间、地点约束等优点。点。点。


技术研发人员：黄和 郭琪 李珂 施天穹
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25