与奶山羊的褪黑素性状相关的SNP标记及其应用

与奶山羊的褪黑素性状相关的snp标记及其应用
技术领域
1.本发明生物工程技术领域，具体地，本发明涉及与奶山羊的褪黑素性状相关的snp标记、特异性扩增snp标记的引物对、特异性扩增snp标记的试剂盒、鉴定奶山羊的snp标记的方法、预测奶山羊的褪黑素表达的方法、及引物对或试剂盒的应用。


背景技术：

2.我国是种业大国，却不是种业强国，绵羊、山羊品种资源丰富，却缺少当家品种。奶山羊（dairy goat）属山羊属（capra hircus）。我国奶山羊（capra hircus）产业起步相对较晚，奶羊育种技术落后，核心群体规模小，产奶性能较低，奶品质较差，生产水平与发达国家仍有较大差距。据世界粮农组织（fao）统计，2019年奶山羊单产最高的国家是卢森堡，为1100.1kg/只/年；中国名列第37位，仅为183.6kg/只/年。随着经济快速发展和生活水平的提高，人民对奶制品的需求与日俱增。山羊奶营养全面，容易被人体消化吸收，还具有强免疫力和抗过敏等保健功能，越来越受到人们的青睐。培育高产高繁优质性状的奶山羊新品种已经成为产业发展当务之急。
3.褪黑素（melatonin，mt）化学名称为n-乙酰基-5-羟色胺，是一种主要由松果体分泌的激素。在动物体内，褪黑素通过下丘脑-垂体-性腺轴直接调控繁殖活动。现在研究证明，生殖系统、消化系统、免疫系统等多种组织和器官均能分泌褪黑素。在大多数哺乳动物体内，褪黑素的合成主要分为三个主要步骤：1）色氨酸经过色氨酸羟化酶(tryptophanehydroxylase, tph)和l-芳香氨基酸脱羧酶(l-aromatic amino acid decarboxylase, aaad)的催化作用后生成5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine, 血清素)。2）5-羟色胺在芳烷基胺n-乙酰转移酶(arylalkylamine-n-acetyltransferase, aanat)的作用下产生n-乙酰-5-羟色胺(n-actylserotonin)。3）n-乙酰-5-羟色胺(n-actylserotonin)在羟基吲哚-氧-甲基转移酶(hydroxyindole-o-methyl transferase，asmt)的催化作用下发生甲基化生成n-乙酰基-5-甲氧基色胺(n-acetyl-5-methoxytryptamine)，即褪黑素。褪黑素发挥其生物学作用，主要通过mt1、mt2途径发挥调控作用。近年来，奶中的褪黑素营养价值逐渐被人们所认识。高浓度褪黑素牛奶具有更好改善睡眠和舒缓压力的功效，还有助于婴儿自身生物节律的形成。同时，国外一些奶业公司纷纷推出了高褪黑素的奶产品，比如“night milk”、“adult milk”、“slumber bedtimemilk”等，销量稳步增加。
4.单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）指的是由单个核苷酸—a、t、c或者g的改变而引起的dna序列的多态性，包括碱基的插入、缺失、转化和变换等。其是限制性片段长度多态性、微卫星标记之后的第3代分子标记。随着snp研究和开发的迅速发展，snp已经成为羊基因组分析的一个重要的研究工具，广泛应用于经济性状位点的定位以及优良性状的选育。在羊的育种中，snp位点标记为制定科学的育种规划、提高遗传进展奠定了重要的理论基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了与奶山羊的褪黑素性状相关的snp标记、特异性扩增snp标记的引物对、特异性扩增snp标记的试剂盒、鉴定奶山羊的snp标记的方法、预测奶山羊的褪黑素表达的方法、及引物对或试剂盒的应用，为选育奶山羊提供技术支持。
6.第一方面，本发明提供了一种与羊的褪黑素性状相关的snp标记。所述snp标记包括：基因组nw_017189541.1的第147316位和/或第147379位碱基；和/或基因组nc_030836.1的第1389193位碱基。
7.基因组nw_017189541.1位于x染色体上n-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶（asmt）基因的编码区。
8.基因组nc_030836.1位于第29号染色体上褪黑素ii型受体（mtnr1b）基因的编码区。
9.在一些实施方式中，所述基因组nw_017189541.1的第147316位碱基是g或c。
10.在一些实施方式中，所述基因组nw_017189541.1的第147379位碱基是c或g。
11.在一些实施方式中，所述基因组nc_030836.1的第1389193位碱基为t或c。
12.在一些实施方式中，所述基因组nw_017189541.1的第147316位和/或第147379位碱基各自对应的氨基酸发生非同义氨基酸突变。
13.在一些实施方式中，所述第147316位碱基对应的氨基酸由e突变为q，和/或所述第147379位碱基对应的氨基酸由p突变为a。
14.在一些实施方式中，所述基因组nc_030836.1的第1389193位碱基各自对应的氨基酸发生非同义氨基酸突变。
15.在一些实施方式中，第1389193位碱基对应的氨基酸由h突变为r。
16.第二方面，本发明提供了一种特异性扩增本发明第一方面提供的snp标记的引物对。所述引物对包括；如seq id no:5和seq id no:6所示的引物对，其用于特异性扩增所述第1389193位的snp标记；如seq id no:7和seq id no:8所示的引物对，其用于特异性扩增所述第147316位的snp标记；和/或如seq id no:7和seq id no:8所示的引物对，其用于特异性扩增所述第147379位的snp标记。
17.seq id no:5所示的核苷酸序列为attctctcccatcatttcctgagt。
18.seq id no:6所示的核苷酸序列为gtcctgctgcccaacttctt。
19.seq id no:7所示的核苷酸序列为ctctcccccagcctatgtg。
20.seq id no:8所示的核苷酸序列为cactcaatatagtgtgcctgtgtg。
21.第三方面，本发明提供了一种试剂盒。所述试剂盒包括本发明第二方面提供的引物对。
22.第四方面，本发明提供了一种鉴定奶山羊的snp标记的方法。所述方法包括以下步骤：提取奶山羊的基因组dna；
以所述基因组dna为模板，使用本发明第二方面提供的引物对进行pcr扩增反应，得到扩增产物；分析所述扩增产物。
23.在一些实施方式中，所述方法还包括：当所述基因组nw_017189541.1的第147316位的基因型为cc和/或第147379位的基因型为gg，和/或所述基因组nc_030836.1的第1389193位的基因型为cc时，对应的奶山羊的褪黑素表达量高。
24.第五方面，本发明提供了一种预测羊的褪黑素表达的方法。所述方法包括以下步骤：提取奶山羊的基因组dna；以所述基因组dna为模板，使用本发明第二方面提供的引物对进行pcr扩增反应，得到扩增产物；分析所述扩增产物。
25.在一些实施方式中，所述方法还包括：当所述基因组nw_017189541.1的第147316位的基因型为cc和/或第147379位的基因型为gg，和/或所述基因组nc_030836.1的第1389193位的基因型为cc时，对应的奶山羊的褪黑素表达量高。
26.第六方面，本发明提供了本发明第二方面提供的引物对在奶山羊育种中的应用。
27.第七方面，本发明提供了本发明第三方面提供的试剂盒在奶山羊育种中的应用。
28.本发明的snp标记与奶山羊的褪黑素性状相关。基因组nw_017189541.1的第147316位基因型为cc、第147379位基因型为gg、和/或基因组nc_030836.1的第1389193位基因型为cc时，奶山羊的褪黑素表达量显著增高，为选育奶山羊提供技术支持，例如选育高褪黑素含量的奶山羊提供技术支持。
附图说明
29.图1显示了snp距离累积分布曲线。
30.图2显示了aanat基因snp分析结果。
31.图3显示了asmt基因snp分析结果。
32.图4显示了mtnr1a基因snp分析结果。
33.图5显示了mtnr1b基因snp分析结果。
34.图6显示了与褪黑素性状显著相关的snp位点基因型。
具体实施方式
35.下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
36.基因组nc_030826.1位于第19号染色体上芳烷基胺-n-乙酰基转移酶（aanat）基因的编码区。
37.基因组nw_017189541.1位于x染色体上n-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶（asmt）基因的编码区。
38.基因组nc_030834.1位于第27号染色体上褪黑素i型受体（mtnr1a）基因的编码区。
39.基因组nc_030836.1位于第29号染色体上褪黑素ii型受体（mtnr1b）基因的编码区。
40.实施例：1. 褪黑素检测（高效液相色谱法）配制1mg/ml褪黑素甲醇色谱级溶液，甲醇依次稀释为100、50、20、10、5ng/l检测峰面积，绘制标准曲线。取200μl血液或乳汁，加800μl甲醇，漩涡振荡30min，4℃，使用14000r/min进行离心，时间为20min，吸取上清液进行过滤，储存于棕色样品瓶，-20℃保存，滤器规格为0.22μm。样品检测后根据样品峰面积计算褪黑素浓度。
41.2. 高褪黑素奶山羊个体选择在高等动物中，褪黑素是由松果体产生的。松果体产生的褪黑素是内分泌激素，会进入血液，乳汁等。因此，本研究应用高效液相色谱法进行褪黑素测定，依据血液和奶中褪黑素检测结果选择高褪黑素奶山羊个体。使用spss 20.0统计软件进行褪黑素浓度与突变的位点的皮尔逊相关性( pearson correlation coefficient）检验。
42.3. 全基因组检测基因组重测序包括样品基因组dna的提取与质检，测序文库构建和上机测序。实验过程质控合格后，以目标数据量为参考进一步调整文库体积，数个文库混合后进行illumina hiseq测序。具体实验步骤如下：（1）基因组dna的提取与质量检测。
43.（2）将基因组dna打断。
44.（3）对dna片段的粘性末端进行补平修复，使用添加碱基“a”的修复方法，将3
′
端转换为粘性末端。
45.（4）粘性末端两侧添加index序列dna接头。
46.（5）使用磁珠进行筛选，收集长度合适的目的片段。
47.（6）pcr扩增在目的片段末端添加index，构建测序文库。
48.（7）通过桥式pcr将测序文库结合到测序芯片上。
49.（8）illumina hiseq上机测序。
50.4. 生物信息分析流程（1）对测序结果原始图像数据利用软件bcf2fastq(version 2.17.1.14)进行图像碱基识别(base calling)初步质量分析，得到测序样本的原始数据(pass filter data，pf)，测序数据以fastq(简称fq)文件格式存储。
51.（2）使用二代测序数据质量统计软件cutadapt(version 1.9.1)对测序原始数据(pass filter data)去除接头以及低质量序列，得到后续信息分析用的clean data。
52.（3）利用dragen genome pipline，将clean data比对到参考基因组序列上，统计比对结果，包括比对上参考序列reads数量，平均深度及覆盖率等。
53.（4）基于比对结果，使用dragen genome pipline进行snp（单碱基突变的检测，对参考基因组每个位点进行检测，检测位点是否存在snp，并将检测结果保存于variant call format(vcf)格式文件中。
54.（5）根据物种的已知基因，将物种的基因组划分为不同的功能单位。然后依据突变所发生的位置，将每个突变位点进行功能区域分类，并对各样本所检测到的突变位点依据
功能区进行分类统计。
55.5. 非同义突变位点验证引物长度在15bp-30bp，其有效长度一般不大于38bp，否则pcr的最适延伸温度会超过taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。gc含量应在40%-60%之间，最适tm值在58℃-60℃。引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3
′
端的互补重叠。引物对的核苷酸序列请参见表1。在表1中，第54512530位和第54511456位碱基位于基因组nc_030826.1芳烷基胺-n-乙酰基转移酶（aanat）上；第147316位和第147379位碱基位于基因组nw_017189541.1n-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶（asmt）上；第29146330位碱基位于基因组nc_030834.1褪黑素i型受体（mtnr1a）上；第1389143位、第1407405位、第1389193位和第1388843位碱基位于基因组nc_030836.1褪黑素ii型受体（mtnr1b）上。
56.表1 引物对的核苷酸序列注：位点p03、p04、p05共用一对引物；位点p06、p07共用一对引物。
57.6. 实验结果6.1 山羊褪黑素浓度结果检测对103只奶山羊第一批羊奶，进行褪黑素检测，其中含量在0-0.5ng/ml共36只占比34.95%，0.5-1ng/ml共51只占比49.51%，1ng/ml以上16只占比15.53%。对于奶中褪黑素含量在1ng/ml以上个体，选取第2批样品中相同个体进行褪黑素检测，并检测血中褪黑素浓度，最终依据两批奶样及血液样品中褪黑素浓度，确定3只高褪黑素奶山羊个体（表2中a1-1至a1-3）及3只低褪黑素奶山羊个体（表2中a2-1至a2-3）进行全基因组测序分析结果如表2所示：
表2 全基因组测序分析样本6.2 测序原始数据质控对6个奶山羊血液样本进行全基因组重测序，原始数据(pass filter data, pf)如表3所示。对原始数据去除低质量序列结果，获得clean date如表4所示，qc后的clean data在pf data中均达到99%以上，统计如表5所示。实验获得的测序数据良好，能够进行后续的相关生信分析。
58.表3 pf data统计注：q20(%)：分别计算phred数值大于20的碱基占总体碱基的百分比；q30(%)：分别计算phred数值大于30的碱基占总体碱基的百分比；gc(%)：计算碱基g和c的数量总和占总碱基数量的百分比；n(ppm)：测序无法判定的碱基n在每百万碱基中含量。
59.表4 clean data数据统计注：q20(%)：分别计算phred数值大于20的碱基占总体碱基的百分比；q30(%)：分别计算phred数值大于30的碱基占总体碱基的百分比；gc(%)：计算碱基g和c的数量总和占总碱基数量的百分比；n(ppm)：测序无法判定的碱基n在每百万碱基中含量。
60.表5 clean data ratio数据统计
6.3 测序过滤数据质控统计利用dragen genome pipline将clean data与参考基因组序列进行比对，比对比例平均达99.64%，比对到参考基因组唯一resds数占所有比对上参考基因组的80.77%，具体如表6所示。平均覆盖率达96.05%，平均覆盖深度达28.32%，具体如表7所示。
61.表6 测序比对统计表7 基因组覆盖率统计6.4 snp检测及注释基于比对结果，使用dragen genome pipline进行snp（单碱基突变）的检测。6个样品的全基因组测序snp的统计如表8所示。根据突变位点所引起的功能改变，将snp划分多种类型，不同的类型snp的统计结果如表9所示。
62.表8 全基因组snp/indel统计
表9 全基因组snp类型统计碱基类型有a，t，c，g四种类型，以参考基因组正链a突变为c为例，结合基因组的正负链关系，实际突变方式为a:t配对碱基，突变为c:g配对碱基，负链中的突变类型则为t》g，因此a》c和t》g类型突变可划归为一类突变，标示为a:t》c:g。因此snp突变方式可以划分为6类，分别为a:t》t:a，a:t》c:g，a:t》g:c，c:g》t:a，c:g》g:c，c:g》a:t。如图1全基因组范围snp突变主要集中在c:g》t:a和a:t》c:g这两种类型。在图1中，横坐标为不同突变类型的snp位点数目；纵坐标为6种突变类型分类。
63.6.5 aanat基因snp分析对高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组的不同个体aanat基因的snp位点进行突变功能区域分类。高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组之间snp数量存在显著的差异，对不同个体之间的snp的突变进行统计，主要存在于c:g》t:a和a:t》g:c两种类型，差异snp位点16个，非同义突变2个，如图2所示（a：snp venn分析；b：snp-突变体类型）。
64.6.6 asmt基因snp分析对高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组的不同个体asmt基因的snp位点进行突变功能区域分类。高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组之间snp数量存在显著的差异，对不同个体之间的snp的突变进行统计，主要存在于c:g》t:a和a:t》g:c两种类型，差异snp位点257个，非同义突变2个，如图3所示（a：snp venn分析；b：snp-突变体类型）。与褪黑素性状相关的非同义突变2个，基因型如图6所示，第147316位的基因型为gg，第147379位的基因型为cc。
65.6.7 mtnr1a基因snp分析对高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组的不同个体mtnr1a基因的snp位点进行突变功能区域分类。高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组之间snp数量上不存在显著的差异，对不同个体之间的snp的突变进行统计，主要存在于c:g》t:a和a:t》g:c两种类型，差
异突变snp位点121个，非同义突变1个，如图4所示（a：snp venn分析；b：snp-突变体类型）。
66.6.8 mtnr1b基因snp分析对高褪黑素奶山羊组和低褪黑素奶山羊组的不同个体mtnra1b基因的snp位点进行突变功能区域分类。高褪黑素奶山羊组snp从属于低褪黑素奶山羊组内，对不同个体之间的snp的突变进行统计，主要存在于c:g》t:a和a:t》g:c两种类型，差异snp位点80个，非同义突变4个，如图5所示（a：snp venn分析；b：snp-突变体类型）。与褪黑素性状相关的非同义突变1个，基因型如图6所示，第1389193位snp标记的基因型为ct。
67.6.9 褪黑素合成酶及受体基因非同义突变位点相关性分析为了进一步验证所发现的snp位点与褪黑素的相关性，使用6.1中提到的103只奶山羊中的100只，对高褪黑素奶山羊和低褪黑素奶山羊的褪黑素合成酶及受体基因的snp突变位点进行统计，其中位于外显子区域发生氨基酸突变的非同义位点9个（详见表10）。将100只奶山羊褪黑素检测浓度与非同义突变位点进行皮尔逊相关性（pearson correlation coefficient）检验，结果发现有3个snp位点预褪黑素表达呈现显著相关性p《0.05。结果示于表11中，3个snp位点与奶山羊的褪黑素表达显著相关。如表10所示，3个snp位点分别为p06对应于基因组nw_017189541.1的第147316位snp标记，p07对应于基因组nw_017189541.1的第147379位snp标记、p04对应于基因组nc_030836.1的第1389193位snp标记。请参见表12，第147316位基因型cc、第147379位基因型gg、第1389193位基因型cc的褪黑素浓度均高于该群体内平均褪黑素浓度1.05ng/ml。如图6所示，第147316位snp标记的基因型为gg，相关性为87%，其他基因型cc（4%），gc（9%）；第147379位snp标记的基因型为cc，相关性为90%，其他基因型gc（7%），gg（3%）；第1389193位snp标记的基因型为ct，相关性为51%，其他基因型cc（15%），tt（34%）。
68.表10非同义突变汇总表11 突变位点显著性检验注：p《0.05表示在0.05水平（双侧）上显著相关，p《0.01表示在0.01水平（双侧）上
显著相关。
69.表12 显著性位点基因型褪黑素浓度可见，本发明提供了与奶山羊的褪黑素性状相关的snp标记。基因组nw_017189541.1的第147316位基因型为cc、第147379位基因型为gg、基因组nc_030836.1的第1389193位基因型为cc时，snp标记与奶山羊的褪黑素表达量显著增高，为选育奶山羊提供技术支持，例如选育高褪黑素含量的奶山羊提供技术支持。
70.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
71.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
72.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种与奶山羊的褪黑素性状相关的snp标记，其特征在于，所述snp标记包括：基因组nw_017189541.1的第147316位和/或第147379位碱基；和/或基因组nc_030836.1的第1389193位碱基。2.根据权利要求1所述的snp标记，其特征在于，所述基因组nw_017189541.1的第147316位碱基是g或c，和/或第147379位碱基是c或g；和/或所述基因组nc_030836.1的第1389193位碱基为t或c。3.一种特异性扩增权利要求1或2所述的snp标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括；如seq id no:5和seq id no:6所示的引物对，其用于特异性扩增所述第1389193位的snp标记；和/或如seq id no:7和seq id no:8所示的引物对，其用于特异性扩增所述第147316位和/或所述第147379位的snp标记。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3所述的引物对。5.一种鉴定奶山羊的snp标记的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提取奶山羊的基因组dna；以所述基因组dna为模板，使用如权利要求3所述的引物对进行pcr扩增反应，得到扩增产物；分析所述扩增产物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：当所述基因组nw_017189541.1的第147316位的基因型为cc和/或第147379位的基因型为gg，和/或所述基因组nc_030836.1的第1389193位的基因型为cc时，对应的奶山羊的褪黑素表达量高。7.一种预测奶山羊的褪黑素表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提取奶山羊的基因组dna；以所述基因组dna为模板，使用如权利要求3所述的引物对进行pcr扩增反应，得到扩增产物；分析所述扩增产物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：当所述基因组nw_017189541.1的第147316位的基因型为cc和/或第147379位的基因型为gg，和/或所述基因组nc_030836.1的第1389193位的基因型为cc时，对应的奶山羊的褪黑素表达量高。9.如权利要求3所述的引物对在奶山羊育种中的应用。10.如权利要求4所述的试剂盒在奶山羊育种中的应用。

技术总结
本发明涉及与奶山羊的褪黑素性状相关的SNP标记、特异性扩增SNP标记的引物对、特异性扩增SNP标记的试剂盒、鉴定奶山羊的SNP标记的方法、预测奶山羊的褪黑素表达的方法、及引物对或试剂盒的应用。对或试剂盒的应用。


技术研发人员：刘国世 吴昊 金海 张鲁 马文奎 谭军 阎来庆 关盛宇 易琪 赵萌萌 姬鹏云
受保护的技术使用者：三亚中国农业大学研究院
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25