一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法

1.本发明涉及纳米生物探针技术领域，更具体而言，涉及一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法。


背景技术：

2.癌症具有高发病率和高死亡率的特点对人类健康造成严重的危害,目前在癌症的诊断和治疗方面主要是采用传统ct/mri成像技术、组织穿刺活检等检测手段以及使用化疗、放疗和手术切除为主的治疗方式，然而肿瘤发生机制复杂、早期诊断困难和易复发造成治疗效果不理想。随着精准医学的到来,肿瘤靶向多模态成像及治疗，对肿瘤的准确诊断和精准治疗带来巨大的提升。其中以正电子发射计算机断层扫描仪(pet/ct)和单光子发射计算机断层扫描仪(spect/ct)为代表核医学分子影像技术,因其极高灵敏度和无限穿透能力被广泛用于癌症早期检查、生物指标示踪、个性化治疗,极大地改善了全球医疗保健。与此同时,放射性核素能够用于局部肿瘤的治疗,也可用于全身转移性肿瘤的治疗，作为一种重要形式为癌症诊断和治疗提供了新的契机。
3.放射性核素治疗主要是采用可以发射α和β类型的核素,利用其放射性核素衰变过程中产生的高能射线杀伤肿瘤细胞,当前临床中β型核素
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i广泛应用于甲状腺癌治疗。将足够剂量的放射性核素定向输送到肿瘤组织是实现放射性核素治疗重中之重，但在放射性治疗核素用于癌症治疗时,核素在体内快速消除和非特异性广泛分布于正常组织,导致疗效降低和造成对正常组织器官的损害。传统的放射性分子探针标记过程复杂、步骤冗长增加了标记的不确定性，因此越来越多研究转而利用纳米颗粒将放射性核素定向输送到肿瘤部位，提高核素的治疗疗效并降低其副作用。
4.纳米颗粒已经在肿瘤成像、精准诊断、基因治疗、药物输送和个性化治疗等临床研究领域表现出优异的效果。纳米颗粒可以增强药物在体内血液循环时间,通过肿瘤血管不完整和淋巴引流不良引起的增强渗透和滞留(enhanced penetration and retention,epr)效应诱导纳米粒子在肿瘤中富集。除此之外,纳米颗粒具有较高的表面积、易修饰、形貌大小可控等特点,能够同时装载各种癌症靶向分子、治疗药物、荧光分子、放射性核素等用于肿瘤精准成像和各种治疗,实现肿瘤的诊疗一体化，为肿瘤诊疗一体化提供了很好的平台。
5.多巴胺作为天然黑色素的主要成分在人体中广泛分布,因而采用多巴胺为原料形成聚多巴胺纳米颗粒在人体内具有良好的生物相容性,为其在人体内应用的安全性提供了保障。聚多巴胺表面有大量的-nh2和-oh可以通过缩合反应偶联含有羧基的分子、通过迈克尔加成反应或席夫碱反应偶联含有氨基或硫醇基团分子以及聚多巴胺中的邻苯二酚基团螯合cu
2
,pb
2
等多种金属离子。随着纳米技术和纳米医学的迅速发展,纳米颗粒可以克服常规放射性药物制剂及其相关药代动力学限制,提高其成像的精准度和治疗疗效,为新型诊疗一体化放射性核素探针的开发提供一个极好的平台。
6.尽管目前对于聚多巴胺纳米材料装载抗肿瘤药物和核素的研究较多,但是大多都
依然停留在单一纳米载体标记、单一治疗性或者成像性核素,这并不利于纳米材料在生物医学中的广泛应用。在同一个载药平台上采用简便的方法标记不同放射性核素可满足不同需求的应用肿瘤多模式联合治疗产生的疗效远大于各种治疗方式单纯的叠加。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种采用水相氧化法合成了大小均一的聚多巴胺纳米颗粒，并在其表面修饰peg和负载声敏剂ix的技术。
8.本发明的另一个方面的目的在于，提供进一步标记了
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tc,
131
i,
177
lu三种核素,构建了一种新的多功能诊疗一体化负载核素探针。
9.本发明的再一个方面的目的在于，提供不同核素标记的核素探针在乳腺癌诊断与联合治疗中的应用。
10.为实现上述目的，本发明一个方面的实施例提供了一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，在pda颗粒表面修饰一层聚乙二醇(peg)和负载ix得到探针pda-peg-ix，然后将核素
131
i、
99m
tc和
177
lu分别标记在pda-peg-ix上得到核素探针。
11.本发明上述实施例提供的具体合成步骤如下：
12.s1、在反应容器内加入超纯水加热，然后加入盐酸多巴胺,调节ph，反应体系由无色逐渐变为黄色再变成深棕色,老化后收集反应液,离心后取上清，去除尺寸过大的聚多巴胺颗粒,得到了大小均一的pda纳米颗粒；
13.s2、取pda加入至另一反应容器内,调节ph,加入mpeg5000-nh2,搅拌,离心清洗后得到pda-peg；
14.s3、称取ix,edc和nhs溶于甲醇溶液中活化,调溶液ph，加入pda-peg搅拌；收集反应液离心清洗至上清无色,将沉淀用pbs溶液重悬,得到最终的探针pda-peg-ix。
15.优选的，在s1中：加入超纯水为90ml，油浴加热至50℃，加入盐酸多巴胺为180mg，用氢氧化钠调ph至8.5，老化时间为5h，4000rpm转速离心时间为5min；
16.在s2中：取5ml浓度为6mg/mlpda，ph调节至9，加入的mpeg5000-nh2为30mg，在室温下搅拌，搅拌时间为2h，需离心清洗3次；
17.在s3中：称取10mg ix,76.68mg edc和15.34mg nhs溶于5ml甲醇溶液中，活化时间为30min,调溶液ph至9,加入1ml浓度为10mg/mlpda-peg后避光搅拌过夜。
18.优选的，测试得到探针pda-peg-ix释放单线态氧的效果，以pbs作为对照组,实验组分为相同探针浓度下不同功率组和同一功率不同超声次数组,前者用不同超声功率激发探针，后者则是每隔1min超声一次，分别超声1、3和5min，采用sosg荧光探针测定单线态氧产生情况。
19.另外，根据本发明上述实施例提供的一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，还具有如下附加技术特征。
20.根据本发明的一个实施例，将核素
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i、
99m
tc和
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lu分别通过氯胺-t法、氯化亚锡(snc
l2
)还原法和dota螯合法标记在pda-peg-ix上。
21.优选的，氯胺-t法标记
131
i:将放射源na
131
i、氯胺t溶液和pda-peg-ix混合室温下搅拌；
22.优选的，氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
99m
tc:将ci na
99m
tco4溶液、氯化亚锡与pda-peg-ix混合后室温下搅拌；
23.优选的，dota螯合法标记
177
lu:将pda-peg-ix调其ph后，取dota加入反应体系中搅拌，最后取
177
luc
l3
加入到反应体系中室温下搅拌，离心除去未标记的核素得到负载核素探针。
24.优选的，氯胺-t法标记
131
i中:将1.8mci放射源na
131
i、100μl氯胺t溶液和5ml pda-peg-ix混合，室温下搅拌15min；
25.优选的，氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
99m
tc中:将1mci na
99m
tco4溶液、200ml氯化亚锡和5ml pda-peg-ix混合后室温下搅拌1h；
26.优选的，dota螯合法标记
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lu中:将5ml pda-peg-ix,naoh调其ph至8.5后，取10mg dota加入反应体系中搅拌过夜，最后取1mci的
177
luc
l3
加入到反应体系中室温下搅拌1h。
27.优选的，氯胺-t法标记
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i中:pda-peg-ix浓度为2mg/ml；
28.优选的，氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
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tc中:氯化亚锡为5mg/ml,0.1m hci、pda-peg-ix浓度为0.2mg/ml；
29.优选的，dota螯合法标记
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lu中:pda-peg-ix浓度为2mg/ml、
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luc
l3
为185mbq/ml,0.04m hci。
30.根据本发明的一个实施例，对标记核素后的负载核素探针进行检测：分别置于2ml pbs和含15％胎牛血清的培养基中,在不同时间点测定放射性活度,初次记作cpm0,离心后沉淀的活度记作cpm1；计算公式为：核素稳定效率＝cpm1/cpm0*100。
31.本研究结果表明pda纳米颗粒具有良好的光热效果,通过调节激光功率和探针浓度达到可控光热治疗。
32.根据本发明的一个实施例，一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，得到负载核素探针在乳腺癌诊断与联合治疗中的应用。
33.由于肿瘤组织处于弱酸环境(ph 6.4-6.8)，同时聚多巴胺纳米载体在酸性条件下会缓慢降解从而导致ix的释放,进一步在超声刺激下能够释放单线态氧。体外细胞实验证实多模式联合治疗可以显著降低细胞存活率。体内外实验表明该探针具有良好的核素标记产率与稳定性。在4t1乳腺癌小鼠模型中,能够对肿瘤的做出快速准确的诊断。
34.本专利与现有技术相比，具有的有益效果是：
35.1.本发明探针除了可以简单快速标记不同用途的放射性核素以外，该探针还可以负载声敏剂以及探针本身可用于光热治疗。
36.2.本发明探针是将核素治疗、光热治疗、声动力治疗联合治疗的诊疗一体化核素探针。
37.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
38.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
39.图1是pda-peg的电镜图；
40.图2是pda与pda-peg-ix的粒径分布图；
41.图3pda-peg与pda-peg-ix的电位图；
42.图4 pda-peg、ix与pda-peg-ix的紫外-可见吸收光谱图；
43.图5是不同浓度pda-peg在同一近红外激光功率(1.5w)下的温度变化图；
44.图6是浓度为100μg/ml的pda-peg在不同近红外激光功率下的温度变化图；
45.图7是pda-peg近红外可控温度变化曲线；
46.图8是pda-peg-ix在不同超声功率下单线态氧释放强度；
47.图9是不同超声次数后pda-peg-ix释放单线态氧的情况；
48.图10是
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lu-pda-peg、
131
i-pda-peg和
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tc-pda-peg随时间变化放射稳定性检测(图10a-c)
49.图11是cck-8检测
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i-pda-peg-ix和游离
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i孵育4h后4t1细胞的存活率；
50.图12是不同治疗组处理细胞后的细胞存活率(**:p《0.01；***:p《0.001)；
51.图13是4t1小鼠瘤内分别注射
99m
tc-pda-peg和游离
99m
tc(400μci,100μl),在不同时间点0.5、2、4、6、8、10、12、24、36和48h采集小鼠全身图像；
52.图14是4t1模型小鼠尾静脉注射
99m
tc-pda-peg(800μci,200μl)γ照相机成像结果。
具体实施方式
53.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
54.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
55.根据本发明一些实施例提供首先合成pda-peg-ix。
56.150ml圆底烧瓶内加入90ml超纯水,油浴加热至50℃，然后加入180mg盐酸多巴胺,用氢氧化钠调ph至8.5。反应体系由无色逐渐变为黄色再变成深棕色,在老化5h后收集反应液,4000rpm离心5min后取上清，去除尺寸过大的聚多巴胺颗粒,得到了大小均一的pda纳米颗粒。取5ml pda(6mg/ml)加入至50ml圆底烧瓶内,调ph至9,加入30mg peg
5000-nh2,在室温下搅拌2h,离心清洗3次后得到pda-peg。
57.称取10mg ix,76.68mg edc和15.34mg nhs溶于5ml甲醇中活化30min,调溶液ph至9,加入1ml pda-peg(10mg/ml)避光搅拌过夜。收集反应液离心清洗至上清无色,将沉淀用pbs溶液重悬,得到最终的pda-peg-ix,4℃避光保存。
58.下面参照附图1-7描述本发明一些实施例的纳米探针体外光热效果评价。
59.取50、100、200、300和400μg/ml浓度的pda-peg分散体系,在808nm近红外激光下(1.5w/cm2,5min)记录其升温效果。取200μg/ml的pda-peg分散体系在不同近红外激光功率(1、1.5、2和2.5w/cm2)照射5min,记录温度并绘制升温曲线。
60.下面参照附图8、9描述本发明一些实施例的纳米探针体外单线态氧检测。
61.为了测试pda-peg-ix释放单线态氧的效果,以pbs作为对照组,实验组分为相同探
针浓度下不同功率组和同一功率不同超声次数组,前者用不同超声功率(1、1.5、2、2.5w/cm2)激发探针，后者则是每隔1min超声一次，分别超声1、3和5min。采用sosg荧光探针测定单线态氧产生情况。
62.下面参照附图10描述本发明一些实施例的纳米探针核素标记和稳定性检测。
63.标记
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i:1.8mci放射源na
131
i,100μl氯胺t溶液,5ml pda-peg-ix(2mg/ml)室温下搅拌15min。标记
99m
tc:1mci na
99m
tco4溶液,200μl氯化亚锡(5mg/ml,0.1m hci)与5ml pda-peg-ix(0.2mg/ml)混合后室温下搅拌1h。标记
177
lu:5ml pda-peg-ix(2mg/ml),naoh调其ph至8.5后，取10mg dota加入反应体系中搅拌过夜。最后取1mci的
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lucl3(185mbq/ml,0.04m hcl)加入到反应体系中室温下搅拌1h，离心除去未标记的核素得到负载核素探针。
64.标记核素后的探针,分别置于2ml pbs和含15％胎牛血清的培养基中,在不同时间点测定放射性活度,初次记作cpm0,离心后沉淀的活度记作cpm1。计算公式为：核素稳定效率＝cpm1/cpm0*100。
65.下面参照附图11、12描述本发明一些实施例的探针体外毒性检测与治疗。
66.4t1小鼠乳腺癌细胞于37℃,5％co2的培养箱中培养,使用含10％胎牛血清,1％双抗的dmem培养基,待其在培养瓶生长达80％以上时,使用0.25％胰蛋白酶消化传代扩增,。
67.取对数生长期的4t1细胞接种于96孔板内,每组设置5个孔,每孔加入8
×
103个细胞,待细胞贴壁后,对照组加入完全培养基,实验组加入不同放射活度(12.5-200μci/ml)的
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i-pda-peg-ix和游离
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i溶液,置于培养箱温育4h。随后弃去培养基,pbs冲洗3次,每孔加入新鲜完全培养基继续孵育20h。pbs洗涤3次后,每孔加入90μl新鲜完全培养基和10μl cck-8试剂,2h后采用酶标仪检测每孔450nm处的吸光度(od)值,计算细胞存活率。
68.96孔板内贴壁生长的4t1细胞,实验组分为pda-peg-ix、ptt、sdt、ptt
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i、sdt
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i和ptt sdt
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i组，对照组加入等量培养基,孵育4h后分别采用808nm激光(1.5w/cm2,5min)进行ptt和超声进行sdt(1.5w/cm2,5min),继续孵育20h后用酶标仪检测细胞存活率。
69.下面参照附图13、14描述本发明一些实施例的
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tc-pda-peg活体成像。
70.4～6周龄雄性balb/c小鼠右后肢皮下注射107个4t1细胞(100μl),待肿瘤体积到100mm3时用于动物实验。小鼠模型瘤内注射
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tc-pda-peg和游离
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tc(400μci,100μl),在不同时间点0.5、2、4、6、8、24、36和48h用γ照相机采集小鼠全身图像。4t1荷瘤小鼠尾静脉注射
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tc-pda-peg(800μci,200μl)后,分别于注射后0.5、2、4、6、8、10、12和24h进行γ照相机显像。
71.根据本发明一些实施例提供统计学分析采用spss 25.0软件进行数据分析，采用独立样本t检验(student’s t检验)进行统计学分析,p《0.05为差异有统计学意义。
72.以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，在pda颗粒表面修饰一层聚乙二醇(peg)和负载ix得到探针pda-peg-ix，然后将核素
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i、
99m
tc和
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lu分别标记在pda-peg-ix上得到负载核素探针。2.根据权利要求1所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，所述探针pda-peg-ix合成步骤如下：s1、在反应容器内加入超纯水加热，然后加入盐酸多巴胺,调节ph，反应体系由无色逐渐变为黄色再变成深棕色,老化后收集反应液,离心后取上清，去除尺寸过大的聚多巴胺颗粒,得到了大小均一的pda纳米颗粒；s2、取pda加入至另一反应容器内,调节ph,加入mpeg5000-nh2,搅拌,离心清洗后得到pda-peg；s3、称取ix,edc和nhs溶于甲醇溶液中活化,调溶液ph，加入pda-peg搅拌；收集反应液离心清洗至上清无色,将沉淀用pbs溶液重悬,得到最终的探针pda-peg-ix。3.根据权利要求2所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，所述s1中：加入超纯水为90ml，油浴加热至50℃，加入盐酸多巴胺为180mg，用氢氧化钠调ph至8.5，老化时间为5h，4000rpm转速离心时间为5min；所述s2中：取5ml浓度为6mg/mlpda，ph调节至9，加入的mpeg5000-nh2为30mg，在室温下搅拌，搅拌时间为2h，需离心清洗3次；所述s3中：称取10mg ix,76.68mg edc和15.34mg nhs溶于5ml甲醇溶液中，活化时间为30min,调溶液ph至9,加入1ml浓度为10mg/mlpda-peg后避光搅拌过夜。4.根据权利要求1或2所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，测试得到探针pda-peg-ix释放单线态氧的效果，以pbs作为对照组,实验组分为相同探针浓度下不同功率组和同一功率不同超声次数组,前者用不同超声功率激发探针，后者则是每隔1min超声一次，分别超声1、3和5min，采用sosg荧光探针测定单线态氧产生情况。5.根据权利要求1所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，将核素
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i、
99m
tc和
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lu分别通过氯胺-t法、氯化亚锡(snc
l2
)还原法和dota螯合法标记在pda-peg-ix上。6.根据权利要求5所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于,所述氯胺-t法标记
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i:将放射源na
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i、氯胺t溶液和pda-peg-ix混合室温下搅拌；所述氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
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tc:将ci na
99m
tco4溶液、氯化亚锡与pda-peg-ix混合后室温下搅拌；所述dota螯合法标记
177
lu:将pda-peg-ix调其ph后，取dota加入反应体系中搅拌，最后取
177
luc
l3
加入到反应体系中室温下搅拌，离心除去未标记的核素得到负载核素探针。7.根据权利要求6所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于,所述氯胺-t法标记
131
i中:将1.8mci放射源na
131
i、100μl氯胺t溶液和5ml pda-peg-ix混合，室温下搅拌15min；
所述氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
99m
tc中:将1mci na
99m
tco4溶液、200ml氯化亚锡和5ml pda-peg-ix混合后室温下搅拌1h；所述dota螯合法标记
177
lu中:将5ml pda-peg-ix,naoh调其ph至8.5后，取10mg dota加入反应体系中搅拌过夜，最后取1mci的
177
luc
l3
加入到反应体系中室温下搅拌1h。8.根据权利要求6或7所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于,所述氯胺-t法标记
131
i中:pda-peg-ix浓度为2mg/ml；所述氯化亚锡(snc
l2
)还原法标记
99m
tc中:氯化亚锡为5mg/ml,0.1m hci、pda-peg-ix浓度为0.2mg/ml；所述dota螯合法标记
177
lu中:pda-peg-ix浓度为2mg/ml、
177
luc
l3
为185mbq/ml,0.04m hci。9.根据权利要求1所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于，对标记核素后的负载核素探针进行检测：分别置于2ml pbs和含15％胎牛血清的培养基中,在不同时间点测定放射性活度,初次记作cpm0,离心后沉淀的活度记作cpm1；计算公式为：核素稳定效率＝cpm1/cpm0*100。10.根据权利要求1所述一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法，其特征在于：所述负载核素探针在乳腺癌诊断与联合治疗中的应用。

技术总结
本发明涉及纳米生物探针技术领域，更具体而言，涉及一种用于核素成像及多模态联合治疗纳米探针的制备方法。采用水相氧化法合成了大小均一的聚多巴胺纳米颗粒,并在表面分别通过迈克尔加成反应和缩合反应修饰一层聚乙二醇(PEG)和负载IX。然后将核素


技术研发人员：安杰 李亚渊 贺鑫怡 菅少洁 陈耀东 武志芳 李思进
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25