gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用

1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。


背景技术：

2.草甘膦是唯一能够有效抑制植物莽草酸代谢途径中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，epsps）的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物发生死亡。在自然界中存在着对草甘膦具有天然抗性的植物，科研者从中发现了不同的抗性机制，并利用这些抗性基因获得草甘膦高耐受性的转基因作物。在现有的抗草甘膦策略中，可大致分为两大类机制：靶点抗性和非靶点抗性。靶点抗性主要就是针对epsps的相关机制，如过表达或突变。非靶点抗性可分为化学修饰、氧化降解、转运等相关机制。
3.2004年，castle等首次发表了关于草甘膦n-乙酰化修饰的研究成果，其团队从土壤微生物地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis中分离到一种草甘膦n-乙酰基转移酶（glyphosate n-acetyltransferase, gat），并通过11轮dna shuffling获得高催化效率的gat酶。该酶属于gnat超家族，可将乙酰基转移到草甘膦的仲胺上，对epsp合成酶就不再具有抑制作用，从而失去了除草剂活性。本发明希望能够找到天然活性高的gat酶，并置换更佳的氨基酸残基来改变gat酶的活性，同时，实验中将以castle团队中第11轮的gat酶作为阳性对照，并暂名为gat
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。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。
5.一种gat3基因，所述gat基因的多核苷酸为 （a）、（b）、（c）或（d）所示：（a）如序列表seq id no：1 所示的多核苷酸；或（b）与seq id no：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有抗草甘膦活性；（c）与seq id no：1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或（d）在seq id no：1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有抗草甘膦活性。
6.一种gat3蛋白，所述gat3蛋白的氨基酸序列为 （a）、（b）或（c）所示：（a）如序列表seq id no：2 所示的氨基酸序列；或（b）与seq id no：2所示的氨基酸至少有90%或以上同源性的氨基酸；或（c）在seq id no：2所示的蛋白基础上进行一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入得到的蛋白突变体，且该蛋白仍具有抗草甘膦活性。
7.一种gat3蛋白突变体，所述突变体包括gat3-17、gat3-35、gat3-38、gat3-53、gat3-77、gat3-93；所述突变体gat3-17为gat3蛋白的氨基酸序列第17位氨基酸残基由l突
变为i；所述突变体gat3-35为gat3蛋白的氨基酸序列第35位氨基酸残基由s突变为g；所述突变体gat3-38为gat3蛋白的氨基酸序列第38位氨基酸残基由m突变为d；所述突变体gat3-53为gat3蛋白的氨基酸序列第53位氨基酸残基由i突变为v；所述突变体gat3-77为gat3蛋白的氨基酸序列第77位氨基酸残基由v突变为m；所述突变体gat3-93为gat3蛋白的氨基酸序列第93位氨基酸残基由v突变为i。
8.包含所述gat3基因的载体。
9.包含所述gat3基因载体的工程菌。
10.检测所述gat3基因任一片段的引物。
11.所述gat3蛋白或所述gat3蛋白的突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。
12.本发明的有益效果：本发明从pfam数据库筛选到一个高抗草甘膦的gat3基因，并且对gat3蛋白进行点突变，进一步获得更高抗草甘膦的gat3蛋白突变体，为培育高抗草甘膦的农作物打下基础。
附图说明
13.图1 为pet28a-gat1载体图谱。
14.图2 为含100 mm草甘膦lk平板定性筛选抗性菌株。
15.图3 为pet28a-gat n转化菌株的mic值。
16.图4 为pet28a-gat n转化菌株的生长曲线。
17.图5 为含100 mm草甘膦lk平板定性筛选抗性菌株。
18.图6 为pet28a-mgat3-n转化菌株的mic值。
具体实施方式
19.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
20.实施例1 载体构建gat抗性基因的选择：在pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）中下载pf00583（pfam: family: acetyltransf_1 (pf00583) (xfam.org) ）蛋白家族的信息，并利用hmmsearch在uniparc database搜索到3043条序列。将上述序列按照90%相似性进行聚类分析，可分为1196类，以类中心序列数值从大至小进行排序，并从中选出18条序列（cluster number 》 20），依次命名为gat 1
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gat 18。
21.18条序列及gat
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（第11轮筛选结果）由常州基宇公司按照大肠杆菌密码子优化并合成各序列片段。以bamhⅰ/sacⅰ双酶切合成载体及pet28a （r）载体，前者用于回收合成片段，后者用于提供载体骨架，各合成片段分别与载体骨架连接形成如图1所示的pet28a-gat1筛选载体。
22.将构建的18个筛选载体转化至trans1-t1菌株中保存，同时，转化至bl21（de3）菌株中进行后续筛选实验。所有菌株均在-20℃冰箱及-80℃冰箱各留存一份。载体骨架和基因片段是通过酶切线性化后用t
4 dna酶连接而成，因此需以酶切的方法对构建的载体进行再次鉴定。挑取转化涂板后培养出的单克隆于5 ml lk液体培养基中，并于200 rpm、37℃摇
床中过夜培养。取2 ml菌液提取质粒并以bamhⅰ和sacⅰ双酶切，若电泳条带能呈现出5kb以上及相应gat片段大小的两条带，即为准确连接的筛选载体。
23.实施例2 转化菌株的抗性筛选菌株活化：取50 μl保藏菌液于5 ml lk液体培养基中，在37℃、200 rpm摇床培养8-10 h。将接菌环在酒精灯外焰上灼烧灭菌，待降温至室温可沾取菌液在lk固体平板上划线，封口后倒置于37℃温箱中过夜培养。
24.向试管中加入5 ml lk液体培养基备用，用灭菌后的镊子夹紧10 μl小枪头，在平板上挑取3个大小适当的单菌落于3支试管中，在200 rpm、37℃摇床培养。若需菌液od600达1.0时，需培养12-13 h。若需菌液od600达0.6时，需培养6-8 h。
25.平板定性筛选：在平板筛选中，菌液需活化至od600达0.60左右。吸取各试管中200 μl菌液，并用酶标仪测定其od600值，选取数值最为接近0.60的菌液并对其进行稀释，调整至0.590-0.610之间。
26.对各菌株用lk液体培养基进行梯度稀释，以10倍稀释为一个梯度，稀释至105倍。取1 ml菌液于2 ml离心管中，在5个稀释梯度的离心管中加入900 μl lk液体培养基，吸取100 μl菌液至第一个稀释梯度离心管中，即将原有菌液稀释至101倍，在离心管盖上标记为“10
1”，再从中吸取100 μl稀释菌液至下一离心管中，即稀释至102倍，标记为“10
2”，并依次完成稀释梯度。
27.在含有100 mm草甘膦的lk方形固体平板上，吸取8 μl各梯度菌液滴加到各小方格中心位置。其中，以每一横行作为一个菌株的稀释梯度，每一竖列从上至下分别为阳性对照gatc11转化菌株、4个实验组转化菌株、空白载体转化菌株。每个菌株有两组平行重复的平板。将各平板封口后倒置于37℃温箱培养40h，拍照并记录菌株生长情况。
28.实验结果如图2所示，从上至下依次为阳性对照、18个实验组及空白载体的转化菌株。其中，gat2及gat3转化菌株的各个稀释梯度菌液的生长状况较其他菌株更好。
29.mic定量筛选：在各菌株的mic值测定时，菌液od600需达到1.0左右。吸取各试管中200 μl菌液，并用酶标仪测定其od600值，选取数值最为接近1.0的菌液并对其进行稀释，调整至0.990-1.010之间。
30.在96深孔板（12*8）中，各竖列为一个浓度梯度，从左至右依次为含有0 mm、10 mm、20 mm、30 mm、40 mm、50 mm、60 mm、70 mm、80 mm、90 mm、100 mm、110 mm草甘膦的m9液体培养基，用排枪从加样槽中依次添加990 μl的m9液体培养基。96深孔板的每4横行即一个菌株12个梯度的4组重复，用排枪从加样槽中吸取10 μl菌液以1%接菌量接入至液体培养基中，封口后放置于200 rpm、37℃摇床培养24 h。用排枪吸取各板中200 μl菌液于酶标板中，测定其od600值并分析各菌株的mic取值。
31.实验结果如图3所示，大多数菌株的生长状况在10 mm草甘膦条件下已有所抑制，因此，认为10 mm可作为是否具有草甘膦抗性的界定浓度。在具有抗性的菌株中，草甘膦对gat1转化菌株的最小抑菌浓度为60 mm，同时也是高抗性菌株中最小的mic取值，因此，认为50 mm可作为高抗菌株的筛选浓度。其中，阳性对照gat
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转化菌株的mic值为90 mm，gat1转化菌株的mic值为60 mm，gat2转化菌株的mic值为70 mm，gat3转化菌株的mic值为100 mm。即gat1、gat2及gat3转化菌株表现出对草甘膦的高抗性。
32.生长曲线测定：在各菌株的mic值测定时，菌液od600需达到1.0左右。吸取各试管中200 μl菌液，并用酶标仪测定其od600值，选取数值最为接近1.0的菌液并对其进行稀释，调整至0.990-1.010之间。
33.向蜂窝板中加入198 μl含有50 mm草甘膦的m9液体培养基，再向其中接入2 μl菌液。将蜂窝板放入全自动生长曲线测定仪中，观测各菌株80h生长曲线。
34.实验结果如图4所示，虽gat1的生长曲线平台期od600值略高于其他菌株，但gat2及gat3的生长状况明显更好一些。
35.实施例3 突变位点筛选突变位点初选：根据18个转化菌株的实验数据，将18条gat序列进行分级如表1所示，并对gat3基因内的各氨基酸位点进行评分，并选择出如下表2所示的12个突变位点。
36.表1 gat基因分级表 2选择的gat3基因内突变位点单突变载体的构建：以pet28a-gat3质粒为模板，以表3所示序列为引物进行pcr扩增。再以回收的pcr
产物作为大片段引物，以pet28a-gat3质粒作为模板进行完整质粒的pcr扩增，从而获得单突变载体。
37.表3单突变载体构建的引物信息将构建的12个单突变载体转化至trans1-t1菌株中保存，同时，转化至bl21（de3）菌株中进行后续筛选实验。所有菌株均在-20℃冰箱及-80℃冰箱各留存一份。
38.因无法自行检测突变情况，将挑取各菌株的单克隆于5 ml lk液体培养基中，在200 rpm、37℃摇床内过夜培养，送菌液进行测序验证，测序引物序列如表4所示。
39.表 4 单突变载体的测序引物平板定性筛选：实验方法同实施例2，实验结果如图5所示，从上至下依次为阳性对照、野生型、12个实验组及空白载体的转化菌株。其中，mgat3-17、mgat3-35、mgat3-38、mgat3-53、mgat3-77、mgat3-93转化菌株的各个稀释梯度菌液的生长状况较其他菌株更好。
40.mic定量筛选：实验方法同实施例2，实验结果如图6所示，此时已难以通过mic值来分析各个菌株间的差异。因此，取50 mm时各个菌株的od600值与野生型gat3转化菌株的比值来进行菌株间差异的比较，结果如表5所示，mgat3-17、mgat3-35、mgat3-38、mgat3-40、mgat3-46、mgat3-53、mgat3-62、mgat3-77及mgat3-93转化菌株在该条件下的生长状况好于野生型
gat3。
41.表 5 在50 mm草甘膦时与gat3转化菌株的od600比值以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种gat3基因，其特征在于，所述gat3基因的多核苷酸为 （a）、（b）、（c）或（d）所示：（a）如序列表seq id no：1 所示的多核苷酸；或（b）与seq id no：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有抗草甘膦活性；（c）与seq id no：1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或（d）在seq id no：1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有抗草甘膦活性。2.一种gat3蛋白，其特征在于，所述gat3蛋白的氨基酸序列为 （a）、（b）或（c）所示：（a）如序列表seq id no：2 所示的氨基酸序列；或（b）与seq id no：2所示的氨基酸至少有90%或以上同源性的氨基酸；或（c）在seq id no：2所示的蛋白基础上进行一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入得到的蛋白突变体，且该蛋白仍具有抗草甘膦活性。3.权利要求2所述gat3蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体包括gat3-17、gat3-35、gat3-38、gat3-53、gat3-77、gat3-93；所述突变体gat3-17为gat3蛋白的氨基酸序列第17位氨基酸残基由l突变为i；所述突变体gat3-35为gat3蛋白的氨基酸序列第35位氨基酸残基由s突变为g；所述突变体gat3-38为gat3蛋白的氨基酸序列第38位氨基酸残基由m突变为d；所述突变体gat3-53为gat3蛋白的氨基酸序列第53位氨基酸残基由i突变为v；所述突变体gat3-77为gat3蛋白的氨基酸序列第77位氨基酸残基由v突变为m；所述突变体gat3-93为gat3蛋白的氨基酸序列第93位氨基酸残基由v突变为i。4.包含权利要求1所述gat3基因的载体。5.包含权利要求4所述gat3基因的载体的工程菌。6.检测权利要求1所述gat3基因任一片段的引物。7.权利要求2所述gat3蛋白或权利要求3所述gat3蛋白的突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。

技术总结
本发明公开了gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。所述gat3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示；突变体包括gat3-17、gat3-35、gat3-38、gat3-53、gat3-77、gat3-93。本发明从Pfam数据库筛选到一个高抗草甘膦的gat3基因，并且对gat3蛋白进行点突变，进一步获得更高抗草甘膦的gat3蛋白突变体，为培育高抗草甘膦的农作物打下基础。为培育高抗草甘膦的农作物打下基础。为培育高抗草甘膦的农作物打下基础。


技术研发人员：柳小庆 苗丽青 田健 陈茹梅 李素贞 周晓今 杨文竹
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/5/25