一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法与流程

一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法
1.本发明属于免疫学检测领域，主要涉及一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法。


背景技术：

2.重金属污染就是由重金属过量累积引起的污染，是导致环境恶化的一个重要因素，重金属污染物进入人体也会对人体造成极大的危害。社会经济的蓬勃发展以及生活质量的不断提高，人们对食品安全问题愈发关注。
3.铅是环境污染物中毒性很大的一种重金属,在自然界中分布广，工业用途多。由于铅是多亲和性毒物，易在人体的某些器官中积蓄起来造成慢性中毒危害人体健康，主要损害神经系统、血液系统、心血管及消化系统，对儿童的作用更为敏感。一些行业通过颁布行业标准规定了铅的最大允许量，其中粮食中的铅现行标准是0.4mg/kg。
[0004][0005]
传统上，环境农产品中重金属残留的检测技术主要依靠大型仪器，如原子吸收分光光度法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱分析、原子荧光光谱分析等，这些重金属检测方法虽然能精确测量样品中重金属含量，但检测相对费时、费力、且费用昂贵，此外，这些方法需大量的样品预处理，并在大型分析设备上进行，需要专业人员操作，难以应用于现场检测。由于上述的不足之处，检测的样品数一般会少于最佳检测数量，导致在随后进行的重金属污染程度和风险的评估工作存在较大的不确定性，受污农产品的监管也难以及时有效开展。
[0006]
免疫学检测方法是一种新型、高效快速的检测方法，是采用人工制备的抗重金属抗体与抗原之间的免疫反应为基础，快速准确的表达所检样品中重金属含量。重金属的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，理论上能应用于能产生合适抗体的任何污染物质，可便携而进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。因此利用免疫学检测方法，能够快速、准确、便捷地检测粮食中铅离子的含量。


技术实现要素：

[0007]
本发明旨在针对现有背景技术中存在的不足，而提供的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法。
[0008]
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法。
[0009]
包括以下步骤：
[0010]
(1)铅离子完全抗原的制备：取4.5～10.0mg重量份载体蛋白、0.8～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.7～0.8mg重量份pb(no3)2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1～3ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0011]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全
抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1～5h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与 tween-20按体积比1000:0.5混合得到；
[0012]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入100～500ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔10～ 12.5ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0013]
发明效益
[0014]
重金属离子铅对人体健康有巨大的毒害作用且没有任何有益的功能，对神经系统、骨骼造血机能、消化系统、生殖系统等均有危害。特别是大脑处于神经系统发育敏感期的儿童，对铅有特殊的敏感性，极易造成儿童发育迟缓等不良后果。随铅污染程度的加大，儿童的智力低下发病率会升高，对于消化系统，铅中毒会损伤肝脏，甚至出现肝硬化或坏死。通过免疫学方法应用于粮食中铅离子含量的检测，能够在较短的时间内测得粮食中铅离子的含量，并且成本较低、结果准确，此方法的提出对于粮食污染起到一定的防治作用，能够在一定程度上减轻粮食污染的几率，从而保障食品安全。
[0015]
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0016]
实施例1
[0017]
(1)铅离子完全抗原的制备：取4.5mg重量份载体蛋白、0.8mg重量份双功能鳌合剂、 0.7mg重量份pb(no3)2及1.4mg重量份三乙胺，于1ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 15℃温度下振荡8h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0018]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0019]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入100ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔10 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0020]
实施例2
[0021]
(1)铅离子完全抗原的制备：取8.4mg重量份载体蛋白、1.5mg重量份双功能鳌合剂、 0.5mg重量份pb(no3)2及3.5mg重量份三乙胺，于2.5ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 25℃温度下振荡20h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes 缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0022]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全
抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0023]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入300ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔11.5 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0024]
实施例3
[0025]
(1)铅离子完全抗原的制备：取8.6mg重量份载体蛋白、1.7mg重量份双功能鳌合剂、 0.8mg重量份pb(no3)2及4.3mg重量份三乙胺，于3ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 30℃温度下振荡22h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes 缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0026]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0027]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入450ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔12.5 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0028]
实施例4
[0029]
(1)铅离子完全抗原的制备：取8.9mg重量份载体蛋白、1.7mg重量份双功能鳌合剂、 0.8mg重量份pb(no3)2及4.2mg重量份三乙胺，于2.5ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 25℃温度下振荡21h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes 缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0030]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0031]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入450ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔11.5 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0032]
实施例5
[0033]
(1)铅离子完全抗原的制备：取9.8mg重量份载体蛋白、1.8mg重量份双功能鳌合剂、 0.8mg重量份pb(no3)2及4.4mg重量份三乙胺，于3ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 30℃温度下振荡23h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes 缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0034]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0035]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入450ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔12.5 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0036]
实施例6
[0037]
(1)铅离子完全抗原的制备：取10.0mg重量份载体蛋白、1.8mg重量份双功能鳌合剂、 0.8mg重量份pb(no3)2及4.5mg重量份三乙胺，于3ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解， 30℃温度下振荡24h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes 缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；
[0038]
(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的 bsa封闭，在37℃孵育1h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20 按体积比1000:0.5混合得到；
[0039]
(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入4.00g待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入500ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔12.5 ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
[0040]
选取一种被测粮食进行上述检测，平行测定6次，以下是部分实验结果：
[0041]
表1对照组、各实施例的测定结果
[0042]
[0043][0044]
酶联免疫的免疫学检测方法属于用酶标仪测定酶促反应信号后与标准曲线对比而实现定量的一种快速检测方法。根据表1可以得出，六组粮食样品的检测结果，其相对标准偏差 (rsd)极小于5％，表明这种通过免疫学方法进行快速检测的方法重现性良好，满足粮食中重金属铅离子含量检测的稳定性要求，平行性相对较好。
[0045]
选取已知重金属铅离子含量的被测粮食，平行测定3次，以下是部分实验结果：
[0046]
表2方法检测准确性结果
[0047][0048]
根据表2可以得到，六组粮食样品的检测结果分别为2.17μg/kg、2.15μg/kg、2.18μg/kg、 2.16μg/kg、2.24μg/kg，均在标准参考样品要求的标准值范围之内，可见通过免疫学方法对所需检测的粮食进行快速检测的方法检测准确度高，且效果好，检测迅速，可以满足检测需求。
[0049]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)铅离子完全抗原的制备：取4.5～10.0mg重量份载体蛋白、0.8～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.7～0.8mg重量份pb(no3)2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1～3ml体积份的hepes缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24h后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于hepes缓冲溶液中保存，分装，得到铅离子完全抗原；(2)包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板的制备：将步骤(1)所得的铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内,铅离子完全抗原的加入量为100ng/well；接着用质量百分比为3％的bsa封闭，在37℃孵育1～5h，于吸水纸上拍干，用pbst溶液洗涤3次得到包被好完全抗原并封闭的elisa酶标板。其中pbst的制备是由0.01m、ph值为7.4的pbs缓冲液与tween-20按体积比1000:0.5混合得到；(3)免疫学检测：将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着封闭，再加入待检样品，于37℃反应至少5min，pbst溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体，每孔加入100～500ng，于37℃孵育至少30min；再用pbst溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠igg，加入量为每孔10～14.5ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用pbst溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。2.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：所述的抗铅单克隆抗体的制备包括以下步骤：将包被铅离子完全抗原注入到balb/c小鼠体内，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。3.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：所述载体蛋白、双功能鳌合剂、pb(no3)2及三乙胺的重量比为(4～8)：(0.7～1.2)：(0.4～0.7)：(2.5～4.0)。4.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：所述载体蛋白、双功能鳌合剂、pb(no3)2及三乙胺的重量比为5：0.9：0.6：3。5.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：所述的底物为tmb(3，3’，5，5
’‑
四甲基联苯胺)显色底物，使用浓度优选为100～150u g/ml。6.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：步骤(1)中的震荡温度为16～30℃，振荡时间为9～24h。7.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：步骤(2)中孵育时间为1～4h。8.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法，其特征在于：步骤(3)中酶标记的羊抗鼠igg加入量为每孔10～12.5ng/we1l。

技术总结
一种快速检测粮食中重金属铅离子的免疫学方法属于免疫学检测领域，该方法包括以下步骤：(1)取载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺，于HEPES缓冲溶液中溶解，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于HEPES缓冲溶液中保存，分装；(2)将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内，接着用质量百分比为3％的BSA封闭，在37℃孵育，用PBST溶液洗涤得到包被好完全抗原并封闭的ELISA酶标板；(3)将铅离子完全抗原包被于酶标板微孔内封闭，再加入待检样品，PBST溶液洗涤，再加入抗铅单克隆抗体；再用PBST溶液洗涤，加入酶标记的羊抗鼠IgG，孵育后用PBST溶液洗涤，再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。行定性和半定量分析。


技术研发人员：王杰文
受保护的技术使用者：深圳中检联检测有限公司
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25