一种沃式葡萄球菌及其在农药废水的生物强化降解中的应用的制作方法

1.本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种沃式葡萄球菌及其在农药废水的生物强化降解中的应用。


背景技术：

2.除草剂既可用作土壤处理剂也可用作茎叶处理剂，广泛用于大豆田、花生地及林地杂草的防除。按照除草剂的不同化学结构，可以分为很多种，如苯甲酸类、环己烯酮类、酰胺类、咪唑啉酮类、磺酰脲类、嘧啶水杨酸类、磺酰胺类等。目前在有效登记状态的农药产品超过4万个，除草剂数量逐年上升。但随着农药残留及其淋溶入地下水，对农作物的轮作及水生生态系统产生了一定影响。因此寻找一种绿色高效的方法降低其在环境中的残留依然是世界各国研究的热点。大量文献表明，除草剂可以通过植物、动物、微生物和紫外线辐射等作用使其降解，其中，生物修复因其效果好、无二次污染等特点，已成为清除环境中农药污染的重要手段。
3.生物强化，即将目的菌株或者菌群接种到污水处理反应系统中以改善特定物质分解代谢的过程，其通过外加微生物来强化污水生物处理的菌群，将污染物转化为危害性更低的化合物来有效减少污染物负荷。一种方式是向反应系统中加入经驯化的纯菌株或者菌群，或者基因工程细菌；另一种是加入与生物降解相关的基因，把目的基因包埋在载体再进行投加。高效的生物强化方法能迅速降低污染物对系统中的微生物群落的毒性，或者有利于选择“合作者”通过协同作用处理复杂污水。
4.咪草酸、咪唑喹啉酸属于咪唑啉酮类除草剂。咪草酸、咪唑喹啉酸是两性分子，具有酸性羧基和碱性喹啉官能团，具有中等水溶性并且可以渗入地下水中。咪唑喹啉酸在食用鱼中的生物蓄积引起了人们对其对人类健康潜在影响的关注。因此，从应用或污染现场快速消除助于保护环境和人类健康。2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸是合成咪草酸、咪唑喹啉酸等咪唑啉酮类化合物的重要中间体，在药物分子、农药、染料及功能材料等领域有着广泛的应用。由于喹啉在各个领域中均有广泛的应用，因此进入环境的途径有很多种。研究表明，喹啉具有较低的可生物降解性，且喹啉自身具有毒性、致癌和致畸效应，如果不能有效降解，一旦排入环境体系，经过生态系统富集后，将对环境和人类造成极大的危害。
5.咪草酸、咪唑喹啉酸及其中间体在环境中的演变取决于受纳水体的ph值，酸性环境限制它们的流动性并减缓生物降解的速率。迄今为止，已有少数报道针对单一咪唑喹啉酸的生物降解技术，挑战在于研发多种除草化合物的微生物降解方法且保证不受环境影响。


技术实现要素：

6.发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一株能够降解多种除草剂及其中间体且在酸性条件下还能快速实现其降解的微生物。
7.本发明还要解决的技术问题是提供一种由上述沃式葡萄球菌制备得到的菌剂及
其制备方法。
8.本发明还要解决的技术问题是提供上述沃式葡萄球菌和上述菌剂在降解除草剂中间体中的应用。
9.为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种沃式葡萄球菌，其分类命名为沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri），菌株名为jg-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年2月28日，保藏编号为cgmcc no. 24442。
10.沃式葡萄球菌主要生物学特性：菌体染色呈革兰氏阳性，镜下为粗大的短球杆状，多为单个或短链状排列（如图1所示）；该菌株在琼脂培养基上形成边缘整齐、表面光滑且不透明的乳白色或淡黄色的凸起状单菌落；在 lb 液体培养基中呈白色絮状生长。所述沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri）的16s核糖体亚基基因序列如seq id no.1所示。
11.本发明所提供的沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri），能够以除草剂中间体作为唯一碳源进行生长；当除草剂中间体初始浓度1g/l时，将沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri）制备的菌剂按10%的体积比接种到无机盐培养基中，24h后除草剂中间体降解率可达到95.17%以上。
12.为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种菌剂，由本发明所述沃式葡萄球菌制备所得。
13.在一种实施方式中，本发明提供了一种由上述沃式葡萄球菌制备得到的液体菌剂，制备方法为：（1）挑选沃式葡萄球菌jg-3单菌落接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；（2）将步骤（1）得到的菌种按体积比为5%-10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；（3）将种子液按体积比1%-5％的接种量接入生产罐培养，发酵完成后即得液体菌剂。
14.其中，所述lb培养基配方为：4g/l酵母粉、8g/l蛋白胨、8g/l氯化钠，ph 7.0-7.5。
15.生产罐所用培养基和种子罐培养基相同，培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo
4 1g/l，nacl 5g/l，caco
3 2g/l，mgso
4 0.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.0-7.5。
16.在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为35℃，全流程培养时间为48-96小时。
17.优选地，发酵结束后菌体数量达到108个/ml以上。
18.为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了所述沃式葡萄球菌和所述菌剂在降解除草剂中间体中的应用。
19.其中，所述除草剂及其中间体为咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2，3-喹啉二甲酸中的任意一种或多种组合。
20.在一些实施例中，所述沃式葡萄球菌和所述菌剂按照1%~5%的体积比接种到含除草剂中间体的待降解物中；在一些实施例中，所述沃式葡萄球菌和所述菌剂按照5%~10%的体积比接种到含除草剂中间体的待降解物中。
21.在一些实施例中，所述应用为在处理含除草剂中间体废水中的应用。在一些实施例中，所述降解的温度为20-30℃。
22.在一些实施例中，待降解产物的ph为3-8。
23.在一些实施例中，待降解产物中，除草剂中间体含量为0.1-1g/l。
24.在一些实施例中，所述除草剂中间体为咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸中的任意一种或多种组合。有益效果：本发明提供了一株能降解除草剂中间体生产废水的沃式葡萄球菌，所述沃式葡萄球菌能高效降解含除草剂中间体的生产废水，24h内可将咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸降解达95.21%以上，在污水处理中的应用中，该菌株可以耐受高浓度的除草剂中间体，且对ph条件的适应范围广。本发明对于治理除草剂污染，保护生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。
附图说明
25.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
26.图1为本发明中沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri）菌体的菌落形态图；图2为沃式葡萄球菌对除草剂中间体的降解率图；图3为ph对沃式葡萄球菌降解效率的影响；图4为温度对沃式葡萄球菌降解效率的影响；图5为沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri）在处理实际含除草剂中间体废水的实验中，除草剂中间体降解率随时间变化的曲线。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
28.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
29.下述实施例中所述接种量，如无特殊说明，均为按照体积比接种。
30.实施例1 菌株的分离、纯化与鉴定。
31.取土样10.0g加入到100ml含有100mg/l咪草酸的无机盐培养基，土样来自长期施用长残留性除草剂咪草酸的土壤，置于30℃、150rpm摇床培养5d，取5 ml培养液转接于咪草烟浓度为200mg/l的无机盐培养基内，相同条件再培养7d后，继续转接直至培养基内咪草酸浓度达到500mg/l。然后将菌液稀释涂布在lb固体培养基上，挑取不同形态的单菌落继续划线培养，直到获得单菌落。挑选不一样形态单菌落，在100mg/l 的无机盐液体培养基中培养21d，使用quechers-液相色谱-串联质谱法检测无机盐培养基中的咪草酸浓度，验证不同菌株咪草酸的降解效果，筛选得到降解咪草酸的优势菌株。
32.无机盐培养基配方为：nh4cl 0.5g/l、kh2po
4 1g/l、na2hpo
4 1g/l、mgcl
2 0.02g/l、cacl
2 0.03g/l，ph 7.0-7.5。
33.lb培养基配方为：4g/l酵母粉、8g/l蛋白胨、8g/l氯化钠，ph 7.0-7.5。
34.将纯化的优势沃式葡萄球菌进行16s rdna测序，测序比对结果表明沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri）jg-3与模式菌株staphylococcus warneri strainnctc11044
的同源性为99.65%。其主要生理学特征为革兰氏阳性，镜下为粗大的短球杆状，多为单个或短链状排列。该菌株在琼脂培养基上形成边缘整齐、表面光滑且不透明的乳白色或淡黄色的凸起状单菌落；在lb液体培养基中呈白色絮状生长，能够以除草剂中间体作为唯一碳源进行生长。
35.实施例2菌剂的制备。
36.挑选沃式葡萄球菌jg-3的单菌落接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期；将种子液按5％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240rpm，培养温度为35℃，全流程培养时间为48-96小时，发酵结束后菌体数量达到108个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
37.lb培养基配方为：4g/l酵母粉、8g/l蛋白胨、8g/l氯化钠，ph7.0-7.5。
38.种子罐培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo41g/l，nacl5g/l，caco32g/l，mgso40.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.0-7.5。
[0039] 实施例3菌株jg-3对除草剂中间体的降解效果。
[0040]
将在培养基中培养到对数期的沃式葡萄球菌的菌株jg-3，以5%的接种量分别接种至含不同除草剂中间体（咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸）的培养基中，所述培养基中，各除草剂中间体的初始浓度均为1g/l，nh4cl0.5g/l、kh2po41g/l、na2hpo41g/l、mgcl20.02g/l、cacl20.03g/l，ph7.0-7.5，在30℃、150r/min条件下摇床中培养。24h后测定各除草剂中间体含量，如图2所示。结果表明，沃式葡萄球菌对咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸分别达到95.21%、95.32%、96.65%和95.87%。
[0041] 实施例4ph对降解效率的影响。将在培养基中培养到对数期的沃式葡萄球菌的菌株jg-3，以5%的接种量接到含有不同除草剂中间体（咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2，3-喹啉二甲酸）的培养基中，所述培养基中，各除草剂中间体的初始浓度均为1g/l，同时含nh4cl0.5g/l、kh2po41g/l、na2hpo41g/l、mgcl20.02g/l、cacl20.03g/l，用1mol/l的盐酸及氢氧化钠调节ph值分别调至3、4、5、6、7、8，在30℃、150r/min摇床中培养，24h后测定各除草剂中间体化合物含量，如图3所示。结果表明，ph在3-8范围内沃式葡萄球菌对咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸的降解率都在90%以上，表明该菌株对ph适用范围较广。
[0042] 实施例5温度对降解效率的影响。将在培养基中培养到对数期的沃式葡萄球菌的菌株jg-3，以5%的接种量接到含有不同除草剂中间体化合物（咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸）的培养基中，所述培养基中，各除草剂中间体的初始浓度均为1g/l，nh4cl0.5g/l、kh2po41g/l、na2hpo41g/l、mgcl20.02g/l、cacl20.03g/l，ph7.0-7.5，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，50r/min摇床中培养，24h后测定各除草剂中间体化合物含量，如图4所示。盐浓度在0%-10%范围内沃式葡萄球菌对咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸的降解率都在92%以上；以上结果表明改菌株对环境温度具有较好适应性。
[0043]
实施例6菌株jg-3在实际废水的降解应用。
[0044]
处理水质来源为咪草酸、咪唑喹啉酸生产污水处理厂进水，处理量为5l，将菌株
jg-3制备的菌剂按照10%(v/v)的投加量投加至污水中，原污水ph 7-8左右，咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸浓度分别为1.2g/l、1.5g/l、0.5g/l、0.7g/l，曝气处理使其溶氧在2mg/l以上，24h后跟踪其降解情况，如图5所示。原污水厂中咪草酸的降解率仅为24%，投加jg-3菌株废水中的咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸的降解率分别达到94.54%、94.76%、93.47%、95.18%。以上实验数据表明，沃式葡萄球菌jg-3在实际除草剂中间体废水中具有良好的应用前景。
[0045]
本发明提供了一种沃式葡萄球菌及其在降解除草剂中间体中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一株沃式葡萄球菌，其分类命名为沃式葡萄球菌（staphylococcus warneri），菌株名为jg-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年2月28日，保藏编号为cgmcc no. 24442。2.一种菌剂，其特征在于，由权利要求1所述的沃式葡萄球菌制备得到。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，其通过如下方法制备得到：（1）挑选沃式葡萄球菌jg-3单菌落接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；（2）将步骤（1）得到的菌种按体积比为5%-10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；（3）将种子液按体积比1%-5％的接种量接入生产罐培养，发酵完成后即得液体菌剂。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，生产罐所用培养基和种子罐培养基相同，培养基配方为：葡萄糖8g/l、酵母膏5g/l、k2hpo
4 1g/l、nacl 5g/l、caco
3 2g/l、mgso
4 0.2g/l、大豆油0.1％(v/v)，ph值7.0-7.5。5.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为35℃，全流程培养时间为48-96小时。6.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，发酵结束后菌体数量达到108个/ml以上。7.权利要求1所述的沃式葡萄球菌或权利要求2-6任一项所述的菌剂在降解除草剂及其中间体中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述除草剂包括咪草酸和咪唑喹啉酸，所述中间体包括2-甲基喹啉和2，3-喹啉二甲酸。9.一种降解农药废水的方法，其特征在于，在农药废水中投加权利要求2-5任一项所述的菌剂。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在降解的过程中，适宜的降解温度为20-30℃，废水ph为3-8，除草剂中间体含量为0.1-1g/l。

技术总结
本发明公开一种沃式葡萄球菌及其在农药废水的生物强化降解中的应用，所述沃式葡萄球菌分类命名为沃式葡萄球菌（Staphylococcus warneri），菌株名为JG-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年2月28日，保藏编号为CGMCC No.24442。本发明的沃式葡萄球菌能高效降解含除草剂中间体的生产废水，24h内可将咪草酸、咪唑喹啉酸、2-甲基喹啉、2,3-喹啉二甲酸降解达95.21%以上，且对pH条件的适应范围广，对于治理除草剂污染，保护生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。民的身体健康等方面具有重要的意义。民的身体健康等方面具有重要的意义。


技术研发人员：陈立伟 孙佳佳 蔡舒
受保护的技术使用者：江苏聚庚科技有限公司
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/5/25