用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器以及制备方法和应用

1.本发明属于电化学发光检测领域，涉及用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器以及制备方法和应用。尤其涉及将适配体分子负载于基于上转换纳米粒子的苝类衍生物(nayf
4-pei-ptca)修饰的玻碳电极表面，即以apt/nayf
4-pei-ptca/gce电极为传感元件，定量检测河水中恩诺沙星的电化学发光分析方法。


背景技术：

2.恩诺沙星(enrofloxacin，enr)，是第二代氟喹诺酮类抗生素。因其抗菌谱广、杀菌性强、不良反应少、与其他抗生素间无交叉耐药性等特点，进而被广泛应用于动物和水产养殖业等领域。但是长期滥用导致恩诺沙星在动物体内富集，并随动物排泄物进入环境，造成环境污染。此外，在水产养殖业中，有大量恩诺沙星残留在水体中，排放过程也使得水环境受到严重污染。一旦环境受到污染，将会产生过敏反应和肠道菌群失衡等严重影响人类健康的因素。目前，多个国家和地区已经规定enr在动物源食品中的最大残留量，如欧盟规定enr的最大残留量为0.3μg/g，我国规定所有食品动物的肌肉、脂肪中最高残留限量为100μg/kg。基于此，建立一种高效、灵敏的恩诺沙星残留检测方法具有重要意义。
3.目前，已有报道的检测恩诺沙星的方法包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、酶联免疫法及光电法等。但这些分析方法在实际应用过程中存在很多局限性，例如，高效液相色谱法虽然具有较高的准确度，但仪器昂贵且灵敏度低；液相色谱-质谱法虽然能够用于定性、定量检测，但是仪器操作专业度高，不适合大批量样品的处理以及现场的快速检测；酶联免疫法仅适用于对大量样品的快速筛选，不宜作为单一检测方法；光电法虽然可以达到较高的灵敏度，但是该法的弊端在于受光源的影响较大，稳定性差。因此，开发一种简单快速、选择性好、无需引入外部电源的电化学发光特异性检测恩诺沙星的方法是必要且极其重要的。
4.电化学发光(ecl)也称为电致化学发光，是电化学方法与化学发光方法的结合与延伸，同时具有电化学方法的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单和化学发光方法的重现性好、试剂稳定、控制容易等优点。并且，无需引入外部光源，在光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，并建立其与待测物关系从而实现微量分析的一种方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术中对恩诺沙星检测的不足，提供一种用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器以及制备方法和应用。本发明是基于上转化纳米粒子(nayf
4-pei)和苝四羧酸(ptca)之间的酰胺键结合，从而得到nayf
4-pei-ptca纳米复合材料，并将其修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高，再通过静电作用负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称apt/nayf
4-pei-ptca/gce传感器)，可特异性识别目标分子恩诺沙星，提高对恩诺沙星的选择性。
6.为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：
7.一种用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器是由含有5'-ccc atc agg ggg cta ggc taa cac ggt tcg gct ctc tga gcc cgg gtt att tca ggg gga-3'碱基序列的适配体负载于nayf
4-pei-ptca纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成，所述nayf
4-pei-ptca纳米复合材料为上转化纳米粒子(nayf4-pei)和苝四羧酸(ptca)之间以酰胺键结合的产物。
8.本发明还提供了上述用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)ptca的制备：
10.将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda)溶于naoh的水溶液中，向上述溶液中缓慢滴加hcl溶液，得到深红色絮状沉淀，通过离心、洗涤、干燥，得到红色固体，即ptca。
11.(2)空心棒状的nayf
4-pei的制备：
12.具体的：将ycl3、ybcl3和ercl3、nacl混合均匀，加入含有pei的乙醇中，将nh4f溶于水中加入上述混合溶液，搅拌均匀，置于聚四氟乙烯反应釜中加热反应(优选200℃下反应24h)，通过离心、洗涤、干燥，得到空心棒状的白色固体，即nayf
4-pei。
13.(3)nayf
4-pei-ptca的制备：
14.将步骤(1)所制备的ptca溶解在dmf中，形成1mg/ml的ptca-dmf溶液，搅拌至均匀，再加入edc和nhs(m/m＝4：1)，冰水浴搅拌(目的是：使反应在恒定温度下进行)，在向其中加入nayf
4-pei(m(ptca)/m(nayf4-pei)＝1：5)，搅拌(时间一般16h)，使两者充分反应后，通过离心、洗涤、干燥，得到产物，即nayf
4-pei-ptca。
15.(4)apt/nayf
4-pei-ptca/gce传感器的制备：
16.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，移取nayf
4-pei-ptca的超纯水分散液(1mg/ml)滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到nayf
4-pei-ptca修饰的玻碳电极；接着，将适配体滴加到nayf
4-pei-ptca/gce的表面，适配体和nayf
4-pei-ptca通过静电结合，再将apt/nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极的冰箱中放置6h-8h，即得到ecl适配体传感器。(冰箱放置时间是传感器性能的关键影响因素，温度不是，本技术使用4℃)
17.最后，本发明提供了用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的应用方法，包括如下步骤：
18.首先配置一系列不同浓度的恩诺沙星标准溶液，将恩诺沙星用水配制成溶液，再加入含k2s2o8的pbs缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的恩诺沙星标准溶液，浓度范围为1.0
×
10-14
mol/l～1.0
×
10-6
mol/l。
19.然后建立线性回归方程，将apt/nayf
4-pei-ptca/gce传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述一系列不同浓度的恩诺沙星标准溶液和所述的含k2s2o8的pbs缓冲溶液溶液中浸泡，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(e-ecl)，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
20.最后进行样品检测：待检样品先经过前处理(前处理主要为过滤杂质，例如取河水
水样200ml，自然静置一段时间后，6000rpm离心10min，吸取上层清液，将其通过0.22μm滤膜过滤)，按照上述同样的电化学发光测试条件进行测试(将滤液配制成含有0.05mol/l k2s2o8的0.1mol/l的pbs缓冲溶液(ph 7.4)，取25ml所得溶液于检测池中)，记录发光强度，所得发光强度，用所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待检样品中恩诺沙星的浓度。
21.进一步的，含k2s2o8的pbs缓冲溶液的配置方法为：用ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲溶液配制含0.05mol/l k2s2o8的pbs缓冲溶液。
22.进一步的，电化学发光测试中光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，浸泡时间为30min(30min时检测值稳定)。
23.与现有技术相比，本发明取得了如下有益效果：本发明设计了一种基于上转换纳米粒子的苝类衍生物的电化学发光适配体传感器，以pei为桥梁将ptca和nayf4相结合，可以获得强度较大且性能稳定的电化学发光体，该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过恩诺沙星对该体系ecl信号强度的增强的机理，实现对恩诺沙星的灵敏检测，本发明的检测范围为1.0
×
10-14
～1.0
×
10-6
mol/l，最低检测限为3.0
×
10-15
mol/l。本发明检测恩诺沙星的操作简单、选择性好、检测成本低、灵敏度高、稳定性好。
附图说明
24.图1是nayf
4-pei(a)、ptca(b)、nayf
4-pei-ptca(c)的扫描电镜图。
25.图2是不同浓度恩诺沙星的ecl-电位曲线图。
26.其中恩诺沙星的浓度按曲线峰值高低从前到后依次为：1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l、1.0
×
10-6
mol/l。
27.图3是加入恩诺沙星前后发光强度的差值和恩诺沙星浓度对数的标准曲线。
28.图4是实施例1传感器对恩诺沙星的特异性检测。
具体实施方式
29.本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
30.本发明下面结合实施例作进一步详述：
31.实施例中提供了一种用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器，是由含有5'-ccc atc agg ggg cta ggc taa cac ggt tcg gct ctc tga gcc cgg gtt att tca ggg gga-3'碱基序列的适配体负载于nayf
4-pei-ptca纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成，所述nayf
4-pei-ptca纳米复合材料为上转化纳米粒子(nayf4-pei)和苝四羧酸(ptca)之间以酰胺键结合的产物，其可以通过实施例1中记载的方法获得，具体如下：
32.实施例1：
33.(1)ptca的制备：
34.将0.1009g苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda)溶于naoh的水溶液(0.05m)中，向上
述溶液中缓慢滴加1m hcl溶液，直至观察到深红色絮状沉淀，通过离心、洗涤、干燥，得到红色固体，即ptca。
35.(2)nayf
4-pei的制备：
36.将8ml ycl3、1.8ml ybcl3、0.2ml ercl3和tmcl3、10ml nacl混合均匀，加入60ml含有20ml pei的乙醇中，将0.12g nh4f溶于10ml水中加入上述混合溶液，搅拌均匀，置于聚四氟乙烯反应釜中200℃加热24h。通过离心、洗涤、干燥，得到白色固体，即ucpns-pei。
37.(3)nayf
4-pei-ptca的制备：
38.将10mg ptca溶解在10ml的dmf中，搅拌1h，再加入40mg edc和10mg nhs，冰水浴搅拌4h，在向其中加入50mg nayf
4-pei，搅拌过夜。通过离心、洗涤、干燥，得到产物，即nayf
4-pei-ptca。
39.(4)修饰电极apt/nayf
4-pei-ptca/gce的制备：
40.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用5μl微量进样器移取4μl nayf
4-pei-ptca的溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到nayf
4-pei-ptca修饰的玻碳电极。接着，将4μl 3μmol/l的适配体滴加到nayf
4-pei-ptca/gce的表面，适配体和nayf
4-pei-ptca通过静电结合，得到apt/nayf
4-pei-ptca/gce。最后，将apt/nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ecl适配体传感器。
41.识别分子apt序列为：apt:5'-hooc-aga tgg ggg ttg agg cta agc cga-3'(厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司)
42.(5)标准曲线的绘制
43.将修饰电极apt/nayf
4-pei-ptca/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于一系列恩诺沙星浓度(1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l和1.0
×
10-6
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，浸泡30min，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(e-ecl)，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：
△iecl
＝5149.83162 1001.84055logc(mol/l)，相关系数(r)为0.9977。线性回归方程的检测范围为1.0
×
10-14
～1.0
×
10-6
mol/l，最低检测限为3.0
×
10-15
mol/l。
44.(6)样品的检测
45.取某河水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.05mol/lk2s2o8的0.1mol/l的pbs缓冲溶液调ph至7.4，取25ml所得溶液用于电化学发光分析，按照步骤(4)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，按步骤(5)所得的线性回归方程计算出待检测样品中恩诺沙星的浓度，其结果列于表1中。
46.本发明的显著优点是开发了一种检测恩诺沙星的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：nayf
4-pei与ptca通过酰胺键紧密结合，并在ecl中体现了两者的协同作用；苝类物质具有很好的电化学活性，上转换纳米粒子(nayf4)具有优异的光学特性，如高强度且稳定的阴极信号，是一种很有前景的新型ecl发光体。该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过恩诺沙星对
该体系ecl信号强度的增强的机理，成功实现对恩诺沙星的灵敏检测，该传感平台可特异性识别检测物恩诺沙星，具有高选择性。本发明对推广适配体传感器在水环境监测等方面的实际应用具有重要的意义。
47.并将实施例1制备的用于检测恩诺沙星的电化学发光传感器进步抗干扰检测，其中将适配体孵育后的工作电极分别在10-6
m诺氟沙星(nfx)、环丙沙星(cip)、氯霉素(cap)、卡那霉素(kan)、金霉素(ctc)、链霉素(stp)干扰物，以及在10-8
m的恩诺沙星(enr)标准液中测试，并再将工作电极在上述物质的混合液中检测，检测结果见图4。
48.从图4可知，具有优异电化学性能的修饰电极上孵育适配体后对恩诺沙星起到选择性识别效果，混合后100倍浓度的干扰物对恩诺沙星的检测影响也很微小。因此该工作电极可以实现恩诺沙星抗干扰的选择性检测。
49.比较例1：
50.(1)apt/nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极的制备
51.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取4.0μl 1.0mg/ml nayf
4-pei-ptca材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极；在nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极表面再滴涂4.0μl 3.0μm适配体(同实施例1)，自然晾干4h，得到apt/nayf
4-pei-ptca/gce传感器，作为电化学发光测试的工作电极。
52.(2)标准曲线的绘制
53.以apt/nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列恩诺沙星浓度(1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l和1.0
×
10-6
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
54.(3)样品的检测
55.取25ml经处理后的河水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中恩诺沙星的浓度，其结果列于表1中。
56.比较例2：
57.(1)apt/nayf4-pei/gce修饰电极的制备
58.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取4.0μl 1.0mg/ml nayf4-pei材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到nayf4-pei/gce修饰电极；在nayf4-pei/gce修饰电极表面再滴涂4.0μl 3.0μm适配体(同实施例1)，自然晾干10h，得到apt/nayf4-pei/gce传感器，作为电化学发光测试的工作电极。
59.(2)标准曲线的绘制
60.以apt/nayf4-pei/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作
为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列恩诺沙星浓度(1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l和1.0
×
10-6
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
61.(3)样品的检测
62.取25ml经处理后的河水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中恩诺沙星的浓度，其结果列于表1中。
63.比较例3：
64.(1)apt/ptca/gce修饰电极的制备
65.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取4.0μl ptca水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ptca/gce修饰电极；在ptca/gce修饰电极表面再滴涂4.0μl 3.0μm适配体(同实施例1)，自然晾干10h，得到apt/ptca/gce传感器，作为电化学发光测试的工作电极。
66.(2)标准曲线的绘制
67.以apt/ptca/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列恩诺沙星浓度(1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l和1.0
×
10-6
mol/l)的标准液中浸泡30min，取出后淋洗，作为工作电极，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s,进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
68.(3)样品的检测
69.取25ml的处理后的河水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中恩诺沙星的浓度，其结果列于表1中。
70.比较例4：
71.(1)nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极的制备
72.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取4.0μl 1.0mg/ml nayf
4-pei-ptca材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极。
73.(2)标准曲线的绘制
74.以nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列恩诺沙星浓度(1.0
×
10-14
mol/l、
1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l和1.0
×
10-6
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
75.(3)样品的检测
76.取25ml经处理后的河水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中恩诺沙星的浓度，其结果列于表1中。
77.表1河水中恩诺沙星的测定结果
78.[0079][0080]
备注：a为三次测定的平均值
[0081]
如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为96％～102％。以上结果表明，不用nayf
4-pei-ptca复合材料修饰而单独用nayf
4-pei或是ptca修饰的玻碳电极后进一步组装传感元件难以检测出恩诺沙星，本发明的复合电极材料用于检测河水中的恩诺沙星是可行的。
[0082]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器，其特征在于：是由恩诺沙星适配体负载于nayf
4-pei-ptca纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成，所述nayf
4-pei-ptca纳米复合材料为上转化纳米粒子(nayf4-pei)和苝四羧酸(ptca)之间以酰胺键结合的产物；所述恩诺沙星适配体核苷酸序列如下所示：apt:5'-ccc atc agg ggg cta ggc taa cac ggt tcg gct ctc tga gcc cgg gtt att tca ggg gga-3'。2.根据权利要求1所述用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将玻碳电极(gce)抛光、清洗后滴加nayf
4-pei-ptca的水分散液于gce表面，自然晾干，得到nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极，然后，再涂滴适配体得到apt/nayf
4-pei-ptca/gce修饰电极，低温储存6-8h备用，得到ecl适配体传感器；nayf
4-pei-ptca通过如下方法获得：将空心棒状结构的nayf
4-pei、nhs以及edc分散在水中，再向其中加入ptca，室温搅拌，通过离心、干燥，得到nayf
4-pei-ptca。3.根据权利要求2所述用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：空心棒状的nayf
4-pei的制备方法包括：将ycl3、ybcl3、ercl3、tmcl3、nacl溶于含有pei的乙醇中，搅拌下加入nh4f，将混合物置于聚四氟乙烯反应釜中加热反应，通过离心、洗涤、干燥，制得白色固体，即nayf
4-pei。4.根据权利要求2所述用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：ptca的制备方法包括：将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda)溶于naoh的水溶液中，向上述溶液中缓慢滴加稀盐酸溶液，直至在溶液中可以观察到深红色絮状沉淀，通过离心、洗涤、干燥，制得红色固体，即ptca。5.根据权利要求1所述的用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器在水中恩诺沙星检测中的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)配制含过硫酸钾(k2s2o8)的磷酸盐(pbs)缓冲溶液；(2)含不同浓度恩诺沙星和0.05mol/l k2s2o8的pbs缓冲溶液的配制；配制恩诺沙星水溶液，再将一定量恩诺沙星水溶液加入含0.05mol/l k2s2o8的0.1mol/l ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的恩诺沙星标准溶液，浓度范围为1.0
×
10-14
～1.0
×
10-6
mol/l；(3)标准曲线的绘制将修饰电极apt/nayf
4-pei-ptca/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度恩诺沙星和0.05mol/l k2s2o8的pbs缓冲溶液溶液中浸泡一定时间，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液作为空白溶液检测发光强度；在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(e-ecl)，建立加入恩诺沙星前后的发光强度差值与恩诺沙星浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；(4)实际样品检测实际样品检测先作前处理再调节ph，按照上述步骤(3)中的同样的电化学发光测试条
件进行测试，记录发光强度，所得发光强度用所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待检样品中恩诺沙星的浓度。6.根据权利要求5所述的用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器在水中恩诺沙星检测中的应用，其特征在于：步骤(3)中修饰电极apt/nayf
4-pei-ptca/gce浸泡时间为30min。7.根据权利要求5所述的用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器在水中恩诺沙星检测中的应用，其特征在于：步骤(4)中前处理方法包括：将待测样品自然静置一段时间后，离心吸取上层清液，再将其将其通过0.22μm滤膜过滤。

技术总结
本发明属于电化学发光检测领域，涉及一种用于特异性检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器以及制备方法和应用，是由恩诺沙星适配体负载于NaYF


技术研发人员：陈智栋 温静 蒋鼎 单学凌 王文昌 徐仿敏
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：2022.02.18
技术公布日：2022/5/25